答复意见.doc

答复意见
1. 对实验所用FRT细胞给以简要介绍,便于读者理解。
在文章中已加入FRT细胞的简要介绍,具体如下:FRT细胞即Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞,具有贴壁紧,胰酶不易消化,生长速度适中,特别与CHO和COS-7等细胞比较具有更易使膜蛋白表达的特点,因此常用于研究氯离子通道及其调节剂高通量筛选的细胞模型。参考文献为:Verkman AS, Galietta LJ. Chloride channels as drug targets[J]. Nat Rev Drug Discov, 2009, 8(2):153-71.
2. 关于pEGFP-Ano1 真核表达载的的构建,方法表述不清楚,使用的是什么载体?融合和未融合EGFP的Ano1构建策略是怎样实现的?文中表述:“序列设计位于开放读码框架两端的引物,其中一个去除下游引物终止密码子,保证C 末端的EGFP 表达,另一个保留下游引物终止密码子,使EGFP 无法正常表达。”但表中引物序列无法显示这种设计,看上去是两组完全不同的引物。请作者重写这一段,详细介绍清楚。
已经添加或者修改。具体如下:pEGFP-Ano1 真核表达载体,
使用的是末端融合有绿色荧光蛋白的pEGFP-N1真核表达载体。NCBI查询小鼠Ano1基因()序列设计位于开放读码框架两端的引物,融合和未融合EGFP名称
融合EGFP的Ano1
未融合EGFP的Ano1 上游引物(5'to3') GAGAAGTA GAGAAGTA
下游引物(5'to3') CCGCTCGAG TA ATG
3. 应在方法部分介绍YFP-H148Q/I152L,及使用荧光淬灭动力学检测Ano1转运I-的能力的策略,便于读者理解。
已经添加,具体如下:荧光蛋白作为理想的活细胞荧光标记物和报告蛋白,广泛应用于检测各种活细胞实验体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。YFP-H148Q/I152L荧光蛋白为YFP(黄色荧光蛋白)突变体,突变后的YFP-H148Q/I152L具有极强的碘离子敏感特性,微量的碘离子就会使YFP-H148Q/I152L荧光蛋白迅速发生淬灭,而广泛存在于细胞内外的氯离子却几乎不能使YFP-H148Q/I152L荧光蛋白淬灭。氯离子通道不仅可转运氯离子也可以转运碘离子等其它阴离子,且转运碘离子的能力强于转运氯离子,因此检测细胞内外含量极微量的碘离子能更敏感的反映氯离子通道的开放情况。该方法由2000年加州大学Verkman AS教授实验室首创,先后应用该方法成功筛选出世界公认的高效特异的CFTR等氯离子通道调节剂。该方法目前已经成为检测氯离子通道功能的一种简便、快捷和有效的常规方法。
4. 图4,英文图注中C、D的标注与正文表述不一致
已修改。
审稿人: 2
给作者的审稿意见
文章还需进一步完善,希望这些修改可以更好地表达文章的主旨。
1. 图3的免疫荧光信号太弱,几乎看不出Cy3的荧光,能否提供荧光信号更好的图片?对于融合EGFP的细胞,除检测绿色荧光信号外,能否同样使用Cy3标记Ano1,并且检验两种荧光信号叠加后是否共定位?对于未融合细胞,能否提供EGFP信号的阴性对照结果?
(1)信号太弱的主要原因为