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荧光探针
19920102203495 宋菊平
性的生理过程。受体-配体的作用一般包括半抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、酶-底物、联砷荧光物质与富含半胱氨酸的肽链之间的作用等。
FLAsH型探针。
Tsien 等提出了一种将荧光素的衍生物在活体细胞内与蛋白质位点专一性共价结合的新方法。Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys 序列(Xaa 是非 Cys 的任意氨基酸)融合或插入到目标蛋白质中,具有细胞膜通透性的联砷-荧光素衍生物与序列专一性地识别,在每个砷原子与两个半胱氨酸的巯基共价结合后发出荧光。FLAsH 能够很方便地在钯催化的条件下,通过三氯化砷与荧光素的醋酸汞盐的转金属化作用一步得到,而且通过加入 1,2-乙二硫醇(EDT)很好地加以分离,得到没有荧光的产物FLAsH-EDT2。但是当与砷原子共价结合的 EDT 被 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys 序列中的巯基替代后,荧光强度增强约 50000 倍。FLAsH-EDT2的荧光淬灭可以用震动失活或光诱导的电子转移机理来解释,而结构较为固定且刚性较大的多肽链能阻止荧光的淬灭。此外,除了绿色的 FLAsH,红色的 ReAsH 和蓝色的 HoXAsH、CHoAsH 等多种衍生物已被成功合成。Vogel 等提出了一种新型的小分子探针,由两部分组成,一部分为荧光基团,另一部分为螯合物,由金属离子与含有三醋酸根的叔胺类化合物组成(NTA)(图式 2)。这种探针能够可逆、专一性地与目标蛋白质的寡聚组氨酸序列结合。
Vogel 等用 Ni-NTA 标记在 N 端含有六聚组氨酸序列的 GFP(GFP-His6)。两者的结合在几秒钟之内即完成。Ni-NTA 作为理想的 FRET 受体几乎完全淬灭了 GFP的荧光。而且此反应的速度与 Ni-NTA 探针的浓度成正比关系,表明 Ni-NTA 与 GFP-His6结合的比例系数为 1:
1。特别要指出的是,Ni-NTA 探针都是通过淬灭与目标蛋白质连接的受体的荧光间接使用的。这是由于对与 Ni-NTA 直接相连的荧光基团的荧光成像相当困难,因为 Ni2+会淬灭荧光并且 Ni-NTA 与寡聚组氨酸序列之间的亲和力并不是特别高。同样是以氨基酸序列作为受体,这种探针优于 FlAsH 的地方是它可以用于氧化环境中。
AGT型探针
Johnsson 等利用人类 DNA 修复蛋白的 6-О-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(hAGT)的特性,提出了一种新的蛋白质荧光标记方法。AGT 的氨基酸残基能识别 6-О-烷基鸟嘌呤,并且将烷基转移连接到自身的一个半胱氨酸的巯基上。AGT 的底物识别性很广,能够识别很多种类的烷基,包括苯甲基。Johnsson 等先将目标蛋白质与 hAGT 融合,鸟嘌呤衍生物与作为标签的荧光团结合作为探针,hAGT 半胱氨酸上的活性硫原子亲核进攻以苯甲基修饰的鸟嘌呤衍生物来完成两者间的结合(图式 3)。由于苯甲基鸟嘌呤与 hAGT 之间存在共价作用,结合比较稳定,可以在数小时内对 hAGT 融合蛋白进行观察。只有探针诱导的细胞内融合蛋白质降解对此过程有影响。由于 hAGT 与 GFP 相比,体积小 31 个氨基酸,因此对目标蛋白质的影响也大大减少。苯甲基鸟嘌呤的衍生物较多,到现在为止,已有 20 多种能够与AGT 进行专一性标记,这是使用 AGT
标记方法的一个优势。然而值得注意的是,在哺乳动物的细胞中,内源的野生型 AGT(wtAGT)也会被苯甲基鸟嘌呤的衍生物识别,从而出现较高的背景标记。为了解决这一缺陷,Johnsson 合成了一种 wtAGT 的抑制剂和一系列能抵抗此抑制剂的 AGT 变体。这样就能使得在这种抑制剂的存在下,wtAGT 失活,而 AGT 变体能够对目标蛋白质进行专一性标记。这种利用 AGT 变体和 wtAGT 抑制剂的方法有许多优势,例如组成 AGT 变体的氨基酸数为 182,与 hAGT(207)相比有所减少;另外 AGT 变体对于
烷基化的 DNA 的亲和力低于 hAGT, 从而专一性得到提高,背景值得到降低。总的说来,AGT 及其变体对蛋白质进行标记具有专一性和很广的底物识别性,但是它的体积仍然较大,这是这种方法的一种内在缺陷。
Halo Tag型探针
PCP、ACP型探针
e提出了一种新的方法,这种方法是基于含有多肽链的蛋白质(PCP)或是含有酰基的蛋白质(ACP)在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase)的催化作用下对蛋白质进行专一性标记。PPtase将磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A(CoA)上转移至ACP或PCP的一个精氨酸侧链上,形成专一性的共价结合。这种方法已经被应用于在酵母菌和哺乳动物细胞中荧光标记α