蓝白斑筛选.doc

蓝白斑筛选
简介
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化,而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
编辑本段适用方面
操作中,添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子,在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA(即目的片段)与含lacz'的载体连接时,会插入进MCS,使α肽链读码框破坏,这种重组质粒不再表达α肽链,将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用,不产生活性β-半乳糖苷酶,即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色,培养表型即呈现白色菌落。
实验中,通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素,这样,一次筛选可以判断出:未转化的菌不具有抗性,不生长;转化了空载体,即未
重组质粒的菌,长成蓝色菌落;转化了重组质粒的菌,即目的重组菌,长成白色菌落。
X-gal只是半乳糖苷酶的作用底物,底物的量没有一个确定的值,只要底物的浓度足够显色就可以了,一般在培养基里,
X-gal的终浓度是40ug/ml,IPTG的终浓度是24ug/ml,就可以显色,我们把这些直接涂在表面上,就更容易显色了,再多就有点浪费了
直接往培养基中添加或者涂布的时候涂布也可以。。。
在培养基里,我们课题组X-gal的终浓度是30-50ug/ml,-1mM/ml,就是1ml培养基里加1微升IPTG。就可以显色.
IPTG的浓度为24mg/ml,x-gel的浓度为20mg/ml,倒到平板后,直接加IPTG 10ul和
x-gel 20ul 涂抹均匀避光保存,或者是1L的培养基里(高压灭菌冷却至60度,或是灭菌好的放在冰箱里的培养基加热溶化再冷却至用手摸着感觉不烫了)再加1ml IPTG和2ml x-gel,混匀后倒平板,避光保存(放在超净台上用干净的报纸遮挡起来)就可以了。
以下是我做菌液扩大培养的方法,希望对你能有帮助:
整个操作都在超净工作台中进行,超净工作台预先紫外灭菌15分钟。将长有蓝白斑的平板及灭过菌的菌液培养管放入超净工作台中,向每个培养管加入3ul的Amp及3ml的LB液体培养基(若LB培养基中已加Amp,则可直接加入管中)。用白枪头挑取白斑后直接打入培养管中,每个样品挑5个斑,尽量挑长在平板中间的、周围有蓝斑生长的的白斑,尽量避免挑的是假阳性。培养管盖盖前用酒精灯撩一下再盖盖。放入培养箱中过夜(大概16h),37度,200转.
一、
1、蓝白筛选的原理
LacZ'是lacZ基因的突变型,编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸(全长1201氨基酸)。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型,只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补,称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段,而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片