一种荧光探针及其合成方法和用途的制作方法.docx

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专利名称:一种荧光探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及化学分析,生物分析,临床医学检测领域,尤其涉及一种荧光探针及其合成方法和用途。
胰酶是以胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶为主组成的多种酶的混合物,可以促进蛋白质、淀粉及脂肪的消化。胰蛋白酶是一种胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶类,对带正电荷的赖氨酸、精氨酸残基的肽键具有选择性。胰蛋白酶还具有酯酶和酰胺酶的活性,能够水解酯键和酰胺键。脂肪酶可以水解甘油三酯的酯键。胰酶的活性能够被有机磷化合物、苯甲基璜酰氟以及来源于胰脏、大豆、利马豆、蛋清的天然胰酶抑制剂等抑制。胰酶活性的异常与很多胰腺疾病有关,所以胰酶抑制剂具有重要的基础和临床价值,开发胰酶抑制剂筛选的方法也具有重要意义。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺和苯甲酰-L-精氨酸-P-萘酰胺测定酰胺酶活力;用苯甲酰-L-精氨酸乙酯和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯测定酯酶活力。与上述这些基于紫外吸收的测定方法相比,荧光检测方法具有更高的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种荧光探针及其合成方法和用途。
荧光探针具有如下结构式
荧光探针的合成方法包括如下步骤
l)在氮气保护下,以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为l:210:l的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚,反应1224h;在510。C下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚,摩尔比为5:68,氮气保护下继续反应2436h;用饱和食盐水洗23次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得
背景技术:
3到中间产物;
2)以二氯甲垸为溶剂,加入摩尔比为1:12:12:、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶,反应l2h;过滤,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。
荧光探针用于化学体系、生物体系中的胰酶和脂肪酶活性检测分析,用于胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂的筛选。
本发明的优点是l)荧光探针的合成仅需两步反应,,且后处理简单;2)原料易得,成本低廉;3)该荧光探针具有非常高的检测灵敏度,适合微量检测,有良好的应用前景。
图1在37"C下,10探针在磷酸盐缓冲溶液()溶液中,与0-%胰酶反应30min后的荧光发射光谱;
图2在37'C下,10探针在磷酸盐缓冲溶液()溶液中,与
0-%脂肪酶反应30min后的荧光发射光谱;
图3在37。C下,lOjiiM探针的磷酸盐缓冲溶液()溶液中,分别加入终浓度0-80(iM的苯甲基璜酰氟,%的胰酶,反应30min后的荧光发射光谱;
图4在37。C下,10探针的磷酸盐缓冲溶液()溶液中,分别加入终浓度0-80^M的苯甲基璜酰氟,%的脂肪酶,反应30min后的荧光发射光谱。
具体实施方式
本发明的合成方程式
COOH
H
1)Et20-BF3一
2)TEA,Et20-BF3
DCC,DMAP
实施例1
1)在氮气保护下,以二氯甲垸为溶剂,加入摩尔比为1:10:1的丁二f酐(lOmmol)、吡咯(lOOmmol)、三氟化硼乙醚(lOmmol),反应24h;在5'
4l(TC下依次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(80mmol),氮气保护下继续反应36h;用饱和食盐水洗3次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,,%;
2)以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1:2:2:()、3-(二乙氨基)-苯酚()、二环己基碳二亚胺()、4-二甲氨基吡啶(),反应2h;过滤,减压蒸馏除去溶剂,,产率24%。实施例2
1)在氮气保护下,以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1:2:1的丁二酸酐(lOmmol)、吡咯(20mmo1)、三氟化硼乙醚(lOmmol),反应12h;在5l(TC下依次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(60mmol),氮气保护下继续反应24h;用饱和食盐水洗2次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,,%;
2)以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为l丄l:()、3-(二乙氨基)-苯酚()、二环己基碳二亚胺()、4-二甲氨基吡啶(),反应lh;过滤,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。,产率23%。实施例3
1)在氮气保护下,以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为l:2:l的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚,反应12h;在51(TC下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚,摩尔比为5:6,氮气保护下继续反应24h;用饱和食盐水洗2次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到中间产物;
2)以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1:1:1:、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶,反应lh;过滤,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。
实施例4
1)在氮气保护下,以二氯甲垸为溶剂,加入摩尔比为1:10:1的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚,反应24h;在510'C下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚,摩尔比为5:8,氮气保护下继续反应36h;用饱和食盐水洗3次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到中间产物;
2)以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1:2:2:、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶,反应2h;过滤,减压蒸馏除去
5溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。实施例5
1)将丁二酸酐(10mmo1)、吡咯(20rnrno1)、BF3'OEt2(10mmol)加入到三颈烧瓶中,氮气保护下注入100ml二氯甲烷;搅拌反应12小时后,在51(TC下依次小心滴加三乙胺(50mmo1)、三氟化硼乙醚(60mmol),氮气保护下继续反应36h;反应结束后,反应溶液用饱和食盐水洗两次(2x20mL),有机相用无水硫酸钠干燥,之后真空旋干有机溶剂。得到的黑色油状物用硅胶柱层析分离
(洗脱剂选用石油醚乙酸乙酯=1:1)。,%。熔点160画162。C;丽R(400MHz,CDC13)(s,2H),(d,2H,J=4Hz),(d,2H,/=),(t,2H,J=8Hz),(t,2H,7=8Hz);13CNMR(100MHz,CDC13),,,,,,,;IR(film):2913,1708,1633,1567,1414,1392,1260,1110,1080,1041,956;ESIMass:m/z=(M+Na+).HRMS(ESI):m/zcalcdfor(C12HuBF2N202-H)—:,。
2)将上述中间产物()、二环己基碳二亚胺()、4-二甲氨基吡啶()、3-(二乙氨基)-苯酚()溶解在干燥的二氯甲烷中(10ml),室温下搅拌反应l小时。旋转蒸干溶剂,硅胶柱层析分离,得最终产物20mg,产率24%。&NMR(400MHz,CDC13)(s,2H),(d,2H,J=4Hz),(t,1H,J=8Hz),(d,2H,J=),(dd,1H,J=,J=),(d,1H,J=8Hz),-(m,1H),(t,2H,J=8Hz),(q,4H,J=),3,02(t,2H,J=8Hz),(t,6H,J=);13CNMR(100MHz,CDC13),,,,,,,,,,,,,,
,;IR(film)v/cm-1:2928,1751,1570,1414,1395,1262,1194,1113,1083,1045;MS(ESI):m/z=(M+H)+:;HRMS(ESI):m/zcalcdfor(C22H24BF2N302+H)+:,;calcdfor(C22H24BF2N302+Na)+:,。
实施例6
使用探针检测检测胰酶及脂肪酶的活性。胰酶和脂肪酶溶液用PBS()配帝U,终浓度分别为O,,,,%。加入探针,使其终浓度为10pM。37"C下下反应30分钟后,采用荧光光谱仪检测荧光发射光谱,激发波长488nm,。实施例7以苯甲基璜酰氟为例,使用探针检测胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂对酶活性
的抑制作用。苯甲基璜酰氟用DMSO配制成10mM储备液小心存放,用前使用PBS()稀释,终浓度分别为0,20,40,60,80)liM。加入探针,使其终浓度为10pM。%%的脂肪酶,37。C下反应30分钟后,采用荧光光谱仪检测荧光发射光谱,激发波长488nm,。
权利要求
1、一种荧光探针,其特征在于该荧光探针具有如下结构式
2、一种如权利要求1所述荧光探针的合成方法,其特征在于包括如下步骤:1)在氮气保护下,以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为
l:210:l的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚,反应1224h;在51(TC下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚,摩尔比为5:68,氮气保护下继续反应2436h;用饱和食盐水洗23次,有机相用无水Na2S04干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到中间产物;2)以二氯甲垸为溶剂,加入摩尔比为1:12:12:、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶,反应l2h;过滤,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。
3、一种如权利要求1所述荧光探针的用途,其特征在于用于化学体系、生物体系中的胰酶和脂肪酶活性检测分析,用于胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂的筛选。
全文摘要
本发明公开了一种荧光探针及其合成方法和用途。合成方法包括如下步骤1)在氮气保护下,以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1∶2~10∶1的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚,反应;依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚,摩尔比为5∶6~8,反应;用饱和食盐水洗,干燥,减压蒸除溶剂,用硅胶柱层析得到中间产物;2)以二氯甲烷为溶剂,加入摩尔比为1∶1~2∶1~2∶~、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶,反应;过滤,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析得到荧光探针。本发明的荧光探针的合成仅需两步反应,且后处理简单;原料易得,成本低廉;具
有非常高的检测灵敏度,适合微量检测,有良好的应用前景。