细胞培养液的配制.ppt

细胞培养液的配制
培养基的选择
依据: 经验、文献、尝试
常用: RPMI1640、DMEM
培养基的来源
市售干粉培养基---自己配制
液体培养基---直接使用(注意有效期)
培养基的除菌方法
过滤除菌: (1) 正压过滤---效率高
(2) 负压过滤---效率低
高压蒸气灭菌:
不含谷氨酰胺,灭菌后另外添加
培养基附加成分的添加
按使用说明或实验要求添加
配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等
临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等
RPMI1640培养液配制过程
准备物品
(1) 不锈钢过滤器, 滤膜(,),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶
(2) 培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水
消毒物品
, 包装, 高压蒸气消毒
配制步骤
(1) , 磁力搅拌20min
(2) 加2g NaHCO3/L, 继续搅拌10min
(3) 加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水, )
链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水, ))
(4) 加1N HCl约3mL, , 继续搅拌
(5) 按要求加血清(血清一般需经56℃,30min灭活)
例如: 10%胎牛血清
无血清培养液 900ml
灭活胎牛血清 100ml
(6) 正压过滤除菌(气压适当, 防止滤膜破裂)
(7) 分装,贮存于4℃,2周内用完。
(8) 无菌试验: 取样, 37℃放置24-72h, 无细菌、霉菌污染方可使用
注意事项
谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃,7d分解50%,放置两周以上时,根据需要添加谷氨酰胺。配制100×母液(200 mmol/L, ), -2 ml母液,终浓度1-4 mmol/L
抗生素在37℃稳定性维持3-4d, 可控制轻度污染。防污染重在无菌操作
1. 物品准备
(1)滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。
(2) 培养粉、 NaHCO3、 1N HCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水