番茄载体构建及遗传转化.doc

目录
摘要 3
Abstract 4
1前言 5
5
MicroRNA的发现及命名 6
MicroRNA的发现 6
MicroRNA的命名 6
MicroRNA的生物合成与特点 7
MicroRNA的生物合成 7
植物与动物MicroRNA的区别 9
植物microRNA的特点 10
有关microRNA的研究方法 10
直接克隆的方法 10
正向遗传筛选法 10
生物信息学 11
其他方法 11
植物microRNA的生物学功能 12
植物microRNA与生长发育的关系 12
植物microRNA与逆境的关系 15
本研究的内容和目的 16
2 材料与方法 17
植物材料 17
菌株、质粒及试剂 17
菌株及质粒 17
相关试剂 17
引物序列及相关信息 17
目的基因的扩增 19
Sly-mir156a片段的获得 19
Sly-mir169c片段的获得 19
PCR产物的回收及纯化 19
TA克隆 20
纯化目的片段与pMD18-T Vector的重组连接 20
重组体的转化与筛选 20
重组质粒转化鉴定与测序分析 21
植物表达载体的构建 21
目的片段的双酶切(SacⅠ和SalⅠ) 21
pMV表达载体的双酶切 22
目的片段与表达载体的连接 23
连接产物转化大肠杆菌 23
遗传转化 23
番茄转化再生植株的PCR阳性检测 24
番茄转化再生植株的Southern杂交检测 24
酶切 24
凝胶处理 25
印迹 25
杂交 26
洗膜及检测 26
目的基因表达量的检测 26
MicroRNA预测靶基因组织表达量的检测 27
转基因植株功能鉴定 27
转Sly-mir169c基因植株苗期抗逆性实验 27
耐旱性实验 28
耐盐性实验 28
转Sly-mir156a基因植株表型观察 28
3 结果与分析 29
Sly-mir156a及Sly-mir169c的克隆 29
表达载体的构建 31
转基因植株的获得 32
转基因植株的PCR检测 32
转基因植株的Southern杂交检测 33
外源基因表达量的检测 35
microRNA靶基因组织表达量的检测 36
Sly-mir156a转基因植株T1代植株表型观察 39
Sly-mir169c转基因植株抗逆性检测 40
耐旱性检测 40
耐盐性检测 42
气孔观察 43
4 讨论 45
超量表达microRNA研究其功能 45
MiR156与番茄生长发育的关系 46
MiR169与番茄非生物逆境应答的关系 47
参考文献 50
致谢 57
附录 58
摘要
番茄是重要的蔬菜作物,其遗传改良的途径就是寻找并利用能够调节植物发育,包括株高、叶片数等重要园艺性状的基因和对环境适应,包括干旱、低温等非生物逆境适应的基因,MicroRNA就是属于这类基因。
MicroRNA是广泛存在于真核生物中的重要的调节因子,在植物和动物中的研究发现其功能是多样的,且在生物体内有着很重要的调节功能,包括生长发育、逆境应答、激素反应和病毒诱导等众多方面。
本研究以番茄作为材料,根据前人研究从microRNA数据库中选取了番茄microRNA家族中Sly-mir156a和Sly-mir169c这两个miRNA,分别构建其超量表达载体并转入番茄中,分析它们在番茄中的功能,并借助生物信息学的手段预测它们在番茄中的靶基因,分析了预测所得靶基因在相应条件下的表达情况,期望能够获得有应用价值的microRNA信息。研究获得的主要结果如下:
克隆了从数据库中选取的番茄两个microRNA的前体,并构建了相应的超量表达载体;
通过农杆菌介导的转基因技术,将上述构建的两个表达载体转入番茄中,获得转基因番茄植株,并通过了PCR及Southern杂交验证,证实外源基因整合到番茄