大肠杆菌质粒DNA的提取 PPT课件.ppt

大肠杆菌质粒DNA的提取_PPT课件大肠杆菌质粒DNA的提取
学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法
掌握质粒DNA制备的方法和原理
实验目的
实验原理
质粒DNA的提取分为三个步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二万基硫酸钠(SDS)可使细胞壁裂解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA 则留在上清液中,将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后,可得到质粒DNA.
实验材料、仪器与试剂
材料:
大肠杆菌DH5α
仪器:
(又称Eppendorf离心管)
微量加样器
台式高速离心机
恒温摇床
冰箱
实验材料、仪器与试剂
试剂:
:内含50mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-Hcl用前加溶菌酶4mg/mL
:内含60mL 5mmol/L KAc、、,该溶液中钾离子浓度为3mmol/L,醋酸根离子浓度为 5mmol/L
酚-氯仿混合液(体积比1:1)酚需在160℃重蒸,加入抗氧化剂8-羟基喹啉,%,并用Tris 缓冲溶液平衡两次。向氯仿中加入异戊醇,使氯仿-异戊醇体积比为24:1

TE缓冲溶液()内含10mmol/L Tris-Hcl、1mmol/L EDTA,令含RNA酶20ug/mL
NaoH溶液(内含1%SDS)
70%乙醇溶液/无水乙醇
实验材料、仪器与试剂
实验过程
1、培养细菌扩增质粒:
将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中,37℃过夜培养
3、分离纯化质粒DNA
加入150uL冷乙酸钾溶液,加盖后倒置数次使其混匀,冰浴15min
10000r/min 离心15min ,将上清倒入另一支干净的离心管中。
(乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物,冰浴15min是为了使沉淀完全。如果上清经离心后仍浑浊,应混匀后再冷却至0℃并重新离心处理)
向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液,震荡混匀,以10000r/min离心2min,将上清转至新的离心管中(用酚与氯仿的混合液除去蛋白,其效果比单独使用酚或氯仿更好)
向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀。室温放置2min后,离心5min倒去上清乙醇溶液,把离心管倒置在吸水纸上吸去液体。
70%乙醇溶液,震荡并离心,倒去上清,干燥,溶于TE缓冲溶液中,-20℃保存