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革兰阴性杆菌产超广谱β内酰胺酶的分布及基因型论文
孟灵张润玲尤崇革王应芳
【摘要】目的: 了解临床分离的革兰阴性杆菌中产ESBLs的流行特征及ESBLs基因型. 方法: 对我院临床分离的革兰阴性杆菌,采用改良三维试验检测产 ESBLs 菌株,用PCR对 ESBLs 基因进行分型. 结果: 175株革兰阴性杆菌分离出49株产ESBLs 菌,阳性率28%,包括大肠埃希菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、弗劳地枸椽酸杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌. 其中,第一位是阴沟肠杆菌(%,17/49),其次是大肠埃希菌(%.freel betalactamases, ESBLs)是质粒介导的由β内酰胺酶(BLA)基因突变而形成的一类酶,是丝氨酸蛋白酶的衍生物. 它可水解头孢噻肟(CTX),头孢他啶(CAZ)等三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素,并可被β内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)抑制[1]. 自1983年德国首次从臭鼻克雷伯杆菌中分离出SHV2基因型ESBL以来,其数量及种类已在世界各地迅速增长. ESBLs基因型主要分为SHV,TEM,CTXM,OXA型和其他型,目前已发现200多种(. /studies/). 不同的国家、地区、医院因其使用抗生素的种类和剂量不同,产ESBLs细菌的检出率、耐药性、基因型也有所差异. 为了解兰州大学第二医院革兰阴性杆菌产ESBLs的流行状况和基因分型,我们对49株革兰阴性杆菌进行了ESBLs的确认及其基因型测定.
1材料和方法
(CTX,30 μg/片),头孢硝噻吩纸片(Nitrocefin),MH琼脂购自英国Oxiod公司;克拉维酸(山西威奇达药业有限公司), 氯唑西林(山西博康药业有限公司);TaKaRa质粒DNA纯化盒,TaKaRa PCR 扩增盒, DNA Marker D3405A,引物购自宝生物(大连)有限公司. PCR分析仪(美国PERKIN ELMER),凝胶成像仪(德国Herolab),ABI DNA 测序仪(美国PE),电泳仪(北京六一仪器厂). 25922、肺炎克雷伯菌700603(卫生部临检中心). 200505~09我院临床分离菌175株革兰阴性杆菌.

,滤菌器过滤后测定β内酰胺酶呈阳性待用. 25922的MH平板中央,具其5 mm处用刀片向外分别切四个裂隙,在各裂隙中分别加入待测粗酶液(30 μL),粗酶液(30
μL)+克拉维酸液(2 mmol/L 10 μL),粗酶液(30 μL)+氯唑西林液(2 mmol/L 10 μL),粗酶液(30 μL)+克拉维酸液(2 mmol/L 10 μL)+氯唑西林液(2 mmol/L 10 μL),35℃过夜培养.
(TEM, SHV, CTXM1型)PCR扩增①引物设计: TEM型 T1(5′ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA3′),T2(5′GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC A3′), 终产物1075 bp;SHV型S1(5′GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC3′),S2( 5′TTA GCG A GTG CTC3′), 终产物928 bp;CTXM1型C1( 5′A TGG TTA AAA AAT CAC TGC3′),C2(5′CCG G CTA TTA CAA ACC GTC G3′) 终产物826 bp. ②质粒提取: mL含有氨苄西林(50 mg/L)的LB培养基35℃过夜培养,经23 000 g离心2 min,沉淀物采用碱裂解法提取质粒DNA. ③反应体系: μL, 10×PCR Buffer(+)(Mg2+PLus)5 μL,dNTP 4 μL, μL,质粒模板2 μL,加去离子水至50 μL. ④反应参数:TEM型变性94℃ 45 s,退火50℃ 45 s,延伸72℃ 1 min共30个循环;SHV型变性94℃ 30 s,退火55℃ 30 s,延伸72℃ 1 min共30个循环;CTX–M型变性94℃ 45 s,退火59℃ 45 s,延伸72℃ 1 min共30个循环.
(大连)有限公司,采用Sanger双脱氧链终止法测序,结果直接在GenBank中(.)进行序列比对分析.
g/L聚丙烯酰胺凝胶,以8 V/cm的电压下进行电泳30 min后,经0.