医学分子生物学资料分子杂交与印迹技术.ppt

第六章分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology
一、分子杂交和印迹技术
(一)分子杂交和印迹技术的基本原理;
(二)影响分子杂交的因素;
(三)核酸探针
(四)分子杂交和印迹技术的种类及应用
掌握分子杂交及印迹技术的基本原理,分子杂交、探针的概念。
熟悉探针的来源,选择探针的基本原则,寡核苷酸探针的选择要求,探针的同位素标记及非同位素标记的特点及种类。核酸分子杂交种类,Southern Blot、 Northern Blot的基本原理、过程及区别。
了解影响杂交反应的因素,各种杂交条件的选择。
核酸分子杂交(nucleic acid hybridization )
分子杂交以DNA的变性和复性为理论基础。DNA在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏,由双链变成单链的过程谓之DNA变性。变性DNA的单链重新合成双链的过程为DNA的复性。
分子杂交是不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。
在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
一、分子杂交与印迹技术的基本原理
DNA的变性(denaturation)
定义:在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链的过程。
本质:只改变二级结构,不改变核苷酸排列
方法:过量酸,碱,加热,变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
变性后其它理化性质变化:
OD260增高粘度下降
比旋度下降浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失
目录
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
例:变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
增色效应:DNA变性,由于解链使更多的共轭双键暴露,使其溶液OD260增高,并与解链程度有一定的比例关系的现象。
目录
热变性
解链曲线:如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260(absorbance,A,A260代表溶液在260nm处的吸光率)值作图,所得的曲线称为解链曲线。
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Tm:变性是在一个相当窄的温度范围内完成。
在DNA变性过程中,紫外光吸收值达到最大值的50%(一半)
时的温度称为DNA的解链温度,又称融解温度
(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。
G、C含量越高,Tm越大;DNA越长,Tm越大;溶液的
离子强度增高,Tm增加。
在Tm时,有一半的DNA双链被打开
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象,这一现象称为复性。
减色效应
DNA复性时,其溶液OD260降低。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火(annealing) 。
目录
变性和复性的应用:
核酸分子杂交(hybridization)
在DNA变性后的复性过程中,如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系,在适宜的条件(温度及离子强度)下,就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。
这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成,也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。