10第十章 核酸分子杂交技术1.ppt

第十章核酸分子杂交技术第一节核酸分子杂交的基本原理
具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列,已知
核酸序列称探针。
杂交有固一液相杂交和液相杂交。
变性
复性
DNA-DNA
杂交双链分子
一、DNA变性与复性
(一)DNA变性
1、定义:某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程,称DNA变性
2、变性的方法:
(1)热变性:温度升高到90~100℃时,双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。
(2)酸碱变性:pH值低于3或高于10时,双链核
酸分子链间的氢键断裂。
(3)化学试剂变性:如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
3、变性后的理化性质变化:
粘度降低
密度增加
紫外吸收值增加
4、DNA变性曲线
AT区先解链
GC区后解链
阶梯式曲线
5、GC含量与Tm值之间的关系
(G+C)%=(Tm-) ×
Tm =(G+C)%×+
(二)复性
1、定义:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程,称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链:
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
2、复性过程
(1)单链分子间碰撞形成局部双链
(2)局部双链周围的碱基如不配对时,双链重新解离
(3)局部双链周围的碱基如配对,则形成中心序列
(4)形成完整的双链分子
3、复性的速率方程(服从二级反应动力学)
dC
dt
=K2C2
(1)
将(1)积分
C
Co
1
1+K2Cot
=
(2)
一半单链DNA分子复性时,(2)式中的为
1
2
1
2
1
1+K2Cot
=
Cot1/2值越大,复性速度越慢
C
Co
(3)
1
K2
Cot1/2=