生物技术制药综合实验报告.docx

生物技术制药实验报告
人表皮生长因子(hEGF)在大肠杆菌中的表达与纯化
生物与制药工程学院
罗飞
2016年7月2日
目录
第一节引言 2
(EGF)概述 2
表皮生长因子(EGF)的结构与性质 2
EGF的生物学效应及应用 3
本实验课程设计的目的与内容 4
第二节 EGF基因的合成与转化表达 5
5
6
试剂材料及试剂 6
仪器设备 6
实验方法 7
试剂及培养基配制方法 7
第三节、实验前的准备 7
7
9
: 9
10
10
11
酶切位点的确定 11
引物设计 12
PCR引物设计的基本原则 12
引物设计 13
第四节、实验篇 14
14
: 14
简化后的并行流程 14
、小组结果展示 15
15
XL10质粒电泳结果显示 16
单酶切实验结果显示 16
PCR结果显示 17
SDS-page 电泳结果展示 18
、个人负责实验模块 18
提取重组质粒 18
电泳检测质粒DNA 19
双酶切并检测 19
EGF基因的PCR扩增验证 19
五、小组讨论篇 21
质粒电泳检测讨论 21
酶切条件讨论 22
PCR体系的讨论 24
SDS-page电泳讨论 26
六、实验总结 27
理论与技能收获 27
27
实验技能的收获 28
科学兴趣的向往 29
第一节引言
(EGF)概述
生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用,它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合,参与细胞的各种生命活动。生长因子可以是维生素,碱基,多肽等。所研究的表皮生长因子,就是一种人机体细胞合成的一种多肽。在生物体内,每个细胞的生长状态不同,在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。
目前,表皮生长因子已得到广泛应用。在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF,多种疾病的诱发原因很多,我们可以用EGF来进行详细的诊断。之后致病的查出原因,给病人减少心理的压力,带来一线生机。在经过强烈的光刺激后,尤其是激光,人们的眼部会有很大的损伤,最严重的就是眼角膜损伤,无法修复。人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。对于这些伤害,我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢EGF的药膏或者是化妆品,使皮肤变得如初。
在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽,还没有命名。是由Cohen在1960年,在提取神经生长因子时,意外发现除此种物质以外的一种多肽[2]。多个科学家对其充满好奇心,在之后的十年内,Savage真正的研究清楚,命名此种多肽为表皮生长因子。
表皮生长因子(EGF)的结构与性质
不同的生物中,表皮生长因子的蛋白一级结构不同。研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸,而少于80个氨基酸,与我们所熟悉的胰岛素一样,表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽,在具有生物活性[4]。如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成。
整个hEGF分子由两个结构域组成。残基1~33,形成N一端结构域;34~53为C一端结构域;成熟hEGF 的序列位于单链多肽的C一末端附近,由53个氨基酸残基组成,并且其C一端和N一端分别由Arg /Asp /Arg /His邻
接,故成熟的EGF分子,可以经专一性Arg内肽酶的作用,从前体释放[6]。二级结构上存在着反平行β片层结构是EGF骨架的常见结构,N一端和C一端在整个三维结构中不会发生什么变动,维持此结构的是由三个二硫键[7](由于6个半胱氨酸的存在),因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”[8]。我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应,同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应,hEGF也会有此种现象。 hEGF-β和 hEGF-γ是hEGF的两种形式,在分子结构和同源性中相似度高,在蛋白中一级结构中即使是在C末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别,当它们作用于不同细胞中的同一个受体,在生物体中的