HD SDI嵌入音频数据分析.docx

HD_SDI嵌入音频数据分析GUS活性的定量检测
目的:定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平
用途:比较某个启动子在不同组织中的表达强度,比较不同启动子在同一组织中的表达强度。
试剂:
磷酸缓冲液母液:
Na2HPO4: Na2HPO4·12H2O
NaH2PO4: NaH2PO4·2H2O
GUS抽提液(1L):PH=
Na2HPO4
NaH2PO4
β-ME 700uL
Na2-EDTA·2H2O
Triton-X 100 1mL
10mM 4-MUG(10×): 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中,4℃避光保存。
(注意:存放时间越久本底信号越强,尽量现配现用)。
Na2CO3反应终止液(1L): Na2CO3溶于1000mL ddH2O。
BSA母液(4ug/ul):40mgBSA溶于10mL ddH2O
4-MU母液(10mM): 4-MU溶于10mL Na2CO3中,4℃避光保存。
Protein Assay Buffer(5×,Bio-Rad -0006):使用前要用ddH2O稀释成1×工作液
仪器及用品:
酶标仪TECAN Infinite M200
酶标板(Nunclon 96 Flat Transparent和Greiner 96 Flat Black)
操作步骤与注意事项:
材料于液氮中研磨成粉末,取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液,充分混匀,置冰上。(注意,尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致,这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近,方便后续操作。)
10000g 4℃离心10min,,则得到总蛋白粗提液(可于4度短期保存或于-70℃长期保存;但不要存于-20℃,该温度下GUS不稳定)。
总蛋白浓度测定(Bradford法):
先取BSA标准品(4ug/ul),用ddH2O稀释8个梯度,浓度分别为2000ng/ul、1000、500、250、125、、、 ng/ul。方法:取8个管子,各加50uL ddH2O,取50uL 4ug/ul的BSA母液加入第一个管子,吸打混匀之后从中再取出50uL加入第二个管子,依此类推。(注意,稀释时至少取50uL进行操作,取少了不准确,浓度偏差会比较大,影响标准曲线的制作。稀释后可在4℃短期保存。)
将各个样品的总蛋白抽提液、空白对照(GUS抽提液)以及8个BSA标准品各取2uL加入到透明酶标板(Nunclon 96 Flat Transparent)中,加入198uL 1×Protein Assay Buffer,在5-20min时间内测定595nm的吸光值。(注意,放置超过20min会产生沉淀。)
TECAN Infinite M200程序设置:(开机、关机顺序请见酶标仪上面的说明书)
打开Magellan软件,点击将弹出放酶标板的座子,将酶标板放上去之后再点一下则把酶标板送入酶标仪。(注意:不是用手推的!放酶标板的时候要记住自己加样的位置,有没有盖盖子)
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