实验二 总糖和还原糖的测定.ppt

实验二总糖和还原糖的测定(3,5~二硝基水杨酸法)
《食品生物化学实验》课程
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掌握3,5~二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理,学会处理721型或722型分光光度计出现的问题
一、实验目的
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二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
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本实验是利用3,5~二硝基水杨酸溶液(DNS法)与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系,可用于比色测定。操作简便,快速,杂质干扰较少。
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三、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的制定
葡萄糖标准液的配制:准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解后,定量转移到100ml容量瓶中,再定容到刻度,摇匀。浓度为1mg/ml。
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取7支25×250mm的试管,分别按下表加入试剂:
管号
0
1
2
3
4
5
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葡萄糖标准液(ml)
0






相当于葡萄糖量(mg)
0






蒸馏水(ml)







3,5二硝基水杨酸(ml)







将各管溶液混合均匀,沸水浴加热5min,取出后立即用冷水冷却到室温,,摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。
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2、样品中总糖和还原糖含量的测定
(1)样品中还原糖的提取:
准确称取10g新鲜材料(或2g材料干样粉末),放在100ml烧杯中,先以少量水调成糊状,然后加50~60ml蒸馏水,于50℃恒温水浴中保温20min,过滤,将滤液收集在100ml容量瓶中,再定容至100ml。
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(2)样品中总糖的水解提取:
准确称取10g新鲜材料(或1g材料干样粉末),放在锥形瓶中,加入10ml 6 mol•L-1 盐酸,15ml水,在沸水浴中加热30min,取出一、二滴置于白瓷板上,加1滴碘~碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂,以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色,过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液10ml于100ml容量瓶中,定容至刻度,混匀备用。
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(3)样品中糖含量的测定:取7支25×250mm试管分别按下表加入试剂:
管号
空白
还原糖
总糖
0
1
2
3
1
2
3
样品溶液(ml)
0






蒸馏水(ml)
2






3,5二硝基水杨酸(ml)







OD
加完试剂后,与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。
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四、实验结果
在Excel绘制葡萄糖标准曲线,并求出标准线性方程。
以表格形式列出实验数据,取样品的OD520平均值用标准线性方程求出相应的糖量,并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。
还原糖(mg•g-1)=
还原糖毫克数×提取液总体积(ml)×稀释倍数
测定用提取液体积(ml)×样品重量(g)
总糖(mg•g-1)=
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积(ml)×稀释倍数
测定用提取液体积(ml)×样品重量(g)
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