分子生物学C11基因分析的基本策略.ppt

第十一章基因分析的基本策略
基因操作——所有涉及到DNA或者RNA操作的技术,或者指所有基因工程和基因工程相关技术
基因分析
基因功能的研究
基因分析的构思
了解基因的组成——基因的DNA序列测定
了解基因在染色体的位置——原位杂交
了解基因在基因组上的拷贝数——Southern Blot
了解基因表达水平——Northern Blot、RT-real time PCR
了解基因表达产物的水平——Western Blot
第一节利用DNA定性定量分析可从不同角度对基因和基因组进行研究
两种DNA序列测定基本技术具有不同的原理和特点
双脱氧链末端终止法(diddeoxy chain termination)或Sanger 法
化学裂解法或(Maxam-Gil-bert 法)
(一)DNA 序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化
DNA序列分析
a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列,其基本原理如下:①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2',3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端,从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中,加入模板DNA,引物(特异性引物,如T7,T3,M13等),DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段,无5'→3'外切酶活性。
b. Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)
    该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中,只有1-2种发生特异性的化学切割反应:碱基的特异性修饰;被修饰的碱基从核糖环上转移;失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰,并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 
    硫酸二甲酯是碱性化学试剂,能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化,在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解,并引起DNA链的断裂。在碱性条件下,肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl,那么,只有C被特异性切割。