报告基因原理及应用.ppt

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Reporter: 何小丹
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荧光素酶报告基因检测试剂盒
Amplite™ Luciferase Reporter Gene Assay Kit *Bright Glow*
2021
2022
2023
报告基因（reporter gene）
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报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
常见的报告基因有β-半乳糖苷酶 、β-葡萄糖醛酸酶和荧光素酶等，其中荧光素酶应用最为广泛。
荧光素酶（luciferase）
荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称
发光昆虫
发光海蜗牛
发光真菌
发光水母
荧光素模型
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萤火虫荧光素酶
最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis
的萤火虫体内的荧光素酶
研究最早，应用范围最广
翻译后无需修饰，直接具有完全酶活性
催化反应需要底物荧光素、ATP、O2、Mg2+等参加
需要裂解细胞
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试剂盒成分
Components
(1 plate)
(10 plates)
(100 plates)
Component A:荧光素酶底物（光敏感）
1瓶
1瓶
1瓶
Component B:检测缓冲液
1瓶（10mL）
1瓶（100mL）
1瓶（1000mL）
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检测原理
荧光素酶（luciferase）可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在反应过程中会发出生物荧光，然后通过荧光测定仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光量 ，经过数据处理计，算出被测样品中luciferase的含量。
通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
luciferin
oxyluciferin
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检测流程
待测样品
检测液
检测荧光强度
制作标曲和检测样品时都要设置对照孔
荧光素酶底物
检测液缓冲液
充分混合
代入标准曲线
计算荧光素酶含量
培养细胞
加入待测化合物
等体积反应
室温孵育，避光
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荧光素酶底物加入检测缓冲液中混匀
检测液加入孔中，测定发光值
待测样品加入96孔板中
Amplite™ Fluorimetric Sphingomyelinase Assay Kit鞘磷脂酶SMase检测试剂盒
磷酸胆碱
SMase
鞘磷脂
应用：Quantifying sphingomyelinase in blood, cell extracts and solutions.
灵敏度:as low as of mU/mL phingomyelinase in solution.
生物样品中赖氨酰氧化酶的活性
传统方法：H3氚 放射性同位素标记
试剂盒：HRP-coupled来检测底物LOX中 H2O2的释放检测。
灵敏度高，低至40 ng
Amplite™ Fluorimetric Lysyl Oxidase Assay Kit赖氨酸氧化酶检测试剂盒