凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测.ppt

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凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测
原 理
免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。
亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。
原 理
Bax——
凋亡相关基因
Bcl-2家族成员
细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）
作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡
原 理
本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。
此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。
器材与试剂
01
仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜
02
材料：培养细胞
03
试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、
04
SABC、DAB 、％H2O2-PBS、
PBS： 磷酸盐缓冲液（ ）
封闭液： 山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释
一 抗： 小鼠IgG，用时PBS稀释
二抗： 生物素标记的羊抗小鼠IgG
％ H2O2-PBS（甲醇）
消除内源性过氧化物酶活性作用
SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素
——生物素——过氧化物酶复合物) ：
抗生物素，起到放大作用
DAB(diaminobenzidine)显色液：
3,3´-二氨基联苯胺
培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）
PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
甲醇固定10min
PBS 洗3次 (轻轻地洗涤)
加入封闭液（1:10） 25µl，37 ℃，30min以上
加一抗（1:300）25µl，37℃，1h以上 (或4℃过夜)
PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl）25µl，37 ℃，1h以上
PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
％ H2O2-PBS/甲醇，37 ℃，30min
PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10µl，混匀）20-30µl，37 ℃，30分钟
PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
DAB显色：
DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各50ul，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。
观察结果
缺糖前 Hela 细胞
缺糖 24h Hela细胞