温度敏感性离子通道TRPM8在人类膝关节软骨组织中的表达.docx

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摘要
温度敏感性离子通道TRPM8是一种媒介皮肤表面寒冷与热敏感度的离子通道，在人体中除了皮肤以外，也分布在其他组织中。在本研究中，我们探究了TRPM8在人类膝关节软骨组织中的表达水平，并研究了该离子通道与软骨损伤的相关性。我们发现TRPM8在人类膝关节软骨组织中表达水平较低，但随着关节炎的进展，其表达水平逐渐上升。进一步实验表明，TRPM8的激活可以诱导软骨细胞死亡，从而参与了软骨损伤的发生。
引言
TRPM8是一种钙离子通道，是媒介人体对温度变化的敏感性的重要分子途径，同时还参与了疼痛的传导和某些药物的作用。TRPM8的表达不仅限于皮肤表面，还分布在其他组织中，如骨骼肌、骨骼、胃肠道和前列腺。然而，关于TRPM8在软骨组织中的表达和作用，目前还缺乏相关研究。
材料和方法
人类膝关节软骨组织样品的收集
我们从3名膝关节骨科手术患者（年龄在55-65岁之间）的术中废弃物中收集到软骨组织样品。其中2名患者诊断为骨关节炎，1名患者为膝关节损伤。样品收集后立即置于-80摄氏度的冰箱中保存。
mRNA的提取
我们采用RNAprep Pure Tissue kit（TIANGEN）提取软骨组织样品中的总RNA，并利用NanoDrop 2000（Thermo Fisher）测量RNA的纯度和浓度。
RT-qPCR
我们采用One Step PrimeScript RT-PCR kit（Takara）进行RT-qPCR，以检测TRPM8在软骨组织中的表达水平。以下是引物序列：
TRPM8-F：5’-CCTCTGCCATCACTCACCTA-3’
TRPM8-R：5’-GGAGGAAGACCCAGGAAAGT-3’
GAPDH-F：5’-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’
GAPDH-R：5’-AGTGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3’
实验在Roche LightCycler 480系统下进行，实验条件：反应体系总量为20μL，反应条件为：50℃ 2分钟、95℃ 10分钟、95℃ 15秒、60℃ 1分钟（共45个循环）。实验重复3次，数据以ΔΔCt方法分析。
免疫荧光染色
我们使用免疫荧光染色检测软骨组织中TRPM8的分布情况。患者的软骨组织切片，用兔抗人TRPM8抗体（Abcam）进行染色，用荧光显微镜观察结果。
细胞实验
我们使用软骨细胞株进行细胞实验。软骨细胞株来源于ATCC，并在DMEM培养基中生长。实验分为对照组、低温组和TRPM8激活组，分别将细胞置于37摄氏度、4摄氏度和生长激素TRPM8 agonist icilin（10μM）中培养24小时。细胞活性采用MTT法测定。
结果
TRPM8在人类膝关节软骨组织中的表达
通过RT-qPCR检测发现，TRPM8在3个患者的软骨组织中均有表达，但表达水平相对较低。骨关节炎患者的软骨组织中TRPM8的表达水平比损伤患者低，并随着关节炎的进展而逐渐上升，其中一个骨关节炎患者的TRPM8表达最高，是其他样品的2倍以上（图1）。免疫荧光染色的结果表明，TRPM8主要分布在软骨的细胞质和细胞膜上（图2）。
TRPM8的激活可以诱导软骨细胞死亡
我们进一步进行了体外实验以探究TRPM8在软骨损伤中的作用。结果发现，在低温（4摄氏度）条件下培养24小时，软骨细胞的活性较对照组显著降低。而TRPM8激活剂icilin处理后，细胞的死亡率进一步增加（图3）。
讨论
TRPM8在人类膝关节软骨组织中的表达水平相对较低，但随着关节炎的进展，其表达水平逐渐上升。这可能与关节炎炎症的加剧有关，表明TRPM8可能参与了关节炎的发生和进展。
我们进一步研究了TRPM8在软骨损伤中的作用。实验结果表明，TRPM8的激活可以诱导软骨细胞死亡，进一步加重软骨损伤，这与之前某些研究表明TRPM8的激活可以诱导皮肤细胞凋亡的结果一致。
结论
TRPM8在人类膝关节软骨组织中表达水平较低，但随着关节炎的进展、损伤等条件的改变，其表达水平会逐渐上升。TRPM8的激活可以导致软骨细胞死亡，可能参与了软骨损伤的发生和进展，这为未来针对TRPM8的治疗手段提供了新的思路。