实验蛋白质含量测定.ppt

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2023
掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法
01
掌握分光光度计的原理和使用方法
02
实验目的
有多少样品可供分析;
蛋白质样品浓度大约是多少;
样品中含有哪些可能影响定量的化学物质；
所选方法是否简单、可靠；
含量测定的专一性要求是否很高。
选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：
1
2

物理性质：紫外吸收法
化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等
染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法
测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。


常用的方法
01
02
蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。
280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差别很大(图1)。
紫外吸收法

图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：% Brij35, K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收光谱。
一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。
缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。
01
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肽键在190nm有强吸收峰。
紫外吸收法
01
不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；
02
测量极其简单迅速；
03
蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。
04
适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。
优点：
紫外吸收法
干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, ，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。
01
用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。
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敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。
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缺点：
紫外吸收法
紫外吸收法
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白溶液（ml）
0






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双蒸水（ml）






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蛋白质含量(mg/ml)
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未知蛋白溶液（ml）
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