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202X
实验二 质粒DNA的分离提取
实验目的
CONTENTS
01
了解碱法提取质粒的原理；
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02
掌握碱法提取质粒的方法。
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1946年，美国科学家Lederburg 首先研究了细菌的性因子,并于1952年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、双链DNA分子，大小可为1kb到200kb，它随寄主细胞稳定遗传。
实验原理
壹
质粒按复制方式分为两种类型：
肆
复制要在蛋白质合成时和DNA聚合酶Ⅲ的存在，只随染色体的复制而复制，拷贝数少，每个细胞只有1－10个。
叁
严紧型质粒
贰
严紧型质粒和松弛型质粒
质粒类型
松弛型质粒
松弛型质粒的复制需要DNA聚合酶Ⅰ，在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10－200个以上的拷贝，有的甚至达到上千个。
壹
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
贰
大多数基因工程使用松弛型质粒。
叁
严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。
质粒的应用
三大要素：
多克隆位点
选择标记
（耐药性，LacZ）
独立的复制单位
T-载体
目前常用的:
03
SDS法
02
煮沸法
01
碱变性法
04
羟基磷灰石层析法
分离质粒DNA方法
在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
01
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
02
碱变性法基本原理
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