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一种结合途径分析
 
 
徐诗文 林东强 姚善泾
(浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，杭州310027)
布洛芬与人血白蛋白位点II动态结合过程的分子模拟：一种结合途径分析
徐诗文 林东强*姚善泾
(浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，杭州310027)
人血白蛋白(HSA)主要有两个药物结合位点，位点I和位点II，许多小分子优先结合在位点II上，包括抗炎类药物布洛芬。本文采用分子模拟方法研究了布洛芬小分子与HSA位点II结合的动态过程，探讨了二者的结合机制。首先构建
了50个随机分布的布洛芬与HSA复合物体系，经50 ns分子动力学模拟，其中一个布洛芬分子稳定结合于位点II。基于该分子的运动轨迹分析，发现布洛芬的结合可分为四个阶段，即远程吸引、表面结合调整、进入位点II空腔和稳定结合。比较范德华和静电相互作用能，发现初期以静电吸引为主，中期在HSA表面的两个极性区域间调整，逐步转移至位点II附近；然后在位点II入口处的极性残基和附近疏水残基的共同作用下，布洛芬进入位点II空腔；进入空腔后，静电和疏水共同作用形成稳定结合。在结合过程中，位点II附近的蛋白表面发生明显改变，体现出一定的“诱导契合”作用，同时分子模拟得到的结合模式和布洛芬-HSA结合的晶体结构类似。结果表明，分子模拟可以辅助研究小分子和蛋白结合的动态过程，从分子水平阐述相关结合机制。
人血白蛋白；位点II；布洛芬；动态结合；分子模拟
1 引言
人血白蛋白(HSA)，是人血浆中含量最丰富的一种蛋白质，占血浆总蛋白含量的60%。HSA能与许多内源性和外源性化合物结合，是一种重要的存储和转运蛋白，还具有维持血液渗透压、组成缓冲体系和为细胞提供原料等诸多生理功能。HSA由585个氨基酸残基组成，单链，呈心形，其中α螺旋约占67%，无β折叠，含有35个半胱氨酸，组成17对二硫键，结构稳定。HSA分子含有三个结构类似的α螺旋区域，分别称为域I、域II和域III，每个结构域又可分为两个亚域，见图1。Sudlow等1指出HSA分子主要有两个疏水性药物结合位点，分别为位于域IIA的位点I(华法令结合位点)和位于域IIIA的位点II(吲哚结合位点)。其中位点II更接近分子表面，且活性较高，易于与小分子结
合，许多药物如布洛芬、洋地黄毒苷等优先结合在位点II上2。位点II由六个α螺旋构成一个独特的空腔结构，入口处由极性残基组成，可提供静电相互作用和氢键；空腔中部为疏水性残基，可提供疏水作用；空腔底部可针对不同分子提供疏水、氢键和静电等杂合作用。对于较大分子量的药物，如地西泮，位II还存在一个由LEU387等侧链偏转形成的亚腔3。
布洛芬，化学名为α-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸，分子结构式见图1，是世界卫生组织、美国FDA唯一共同推荐的儿童退烧药，也是儿童首选抗炎药，还适用于骨关节炎、类风湿性关节炎和神经炎等治疗4。布洛芬的羧基在pH中性条件下解离，带一个单位负电荷。布洛芬与HSA结合的晶体结构已经解析，蛋白质数据库编号(PDB ID)为2BXG，存在两个结合位点，其中位点II最为常见，结合模式见图1，由位点II入口到空腔内部形成静电、疏水和杂合的典型三层相互作用分布5。带负电荷的羧基可与位点II空腔入口处三个带正电荷的残基发生静电相互作用；布洛芬的苯环与空腔中部环状分布的4个亮氨酸形成强疏水相互作用；布洛芬分子尾部的异丁基链可与空腔底部的疏水残基发生作用。布洛芬与HSA位点II的稳定结合，取决于布洛芬分子和位点II空腔的独特结构6－8，虽然最终结合方式目前已经了解，但结合的动态过程仍旧未知，HSA是如何吸引布洛芬分子，布洛芬分子又是如何进入位点II的空腔口袋，这些信息的获得将提高人们对HSA-小分子结合过程的机制认识，有助于结合配基的优化设计。
图1 HSA(a),布洛芬(b)以及二者结合(c) HSA(a),ibuprofen(b),and the ibuprofen-HSA binding(c)
近些年来，随着分子模拟技术的不断发展，越来越多的蛋白与小分子的结合模式和机理可以在分子水平上得到阐述，同时分子模拟的结果也为配基设计提供了理论依据，遗憾的是蛋白-小分子结合的动态过程研究很少9－12。本文采用分子动力学模拟的方法，以布洛芬与HSA位点II的动态结合过程为研究对象，分析结合途径，考察结合过程的分子识别、分子相互作用、结合能量和蛋白构象变化，探讨主要作用力、关键残基和结合机制，并与结合的晶体结构进行比较，获得规律性认识，为基于HSA位点II的配基设计和HSA分子改造提供指导。
2 分子模拟方法
HSA的晶体结构从蛋白数据库(Protein Data Bank，/)下载，包括未结合小分子的HSA晶体结构(PDB ID：1AO6)和HSA-布洛芬复合物的晶体结构(PDB ID：2BXG)。采用H++在线平台13(/)计算HSA氨基酸残基在pH ， mol·L－1，蛋白质内部介电常数为10，外部介电常数为80，其它参数为默认。布洛芬分子由Discovery Studio (DS )14构建，采用Dreiding力场优化15，各原子的质子化状态依据Marvinsketch计算的pKa值确定16。
为了让本文分子模拟工作更具有意义和挑战，采用1AO6作为HSA的起始构象，探讨其与随机分布的布洛芬分子的自由结合过程。布洛芬分子的随机分布由packmol软件17实现，以HSA为中心，在边长12 nm的立方体中随机分布50个布洛芬分子构建复合物体系，见Supporting Information中图S1所示。
分子动力学模拟采用Gromacs ，温度设为300 K，采用周期性边界。具体模拟过程如下：首先添加GROMOS96的43a1力场，采用spc水模型进行溶剂化19，最小边界厚度为1 nm，添加Na+以中和系统中的负电荷；其次，采用最陡下降法(steepest descent)进行5×104步能量最小化，再分别进行100 ps的等温等容平衡(NVT)和等温等压平衡(NPT)；最后，在常温常压下进行50 ns的分子动力学模拟，前15 ns为50个布洛芬分子和HSA的完整体系模拟，后35 ns集中于位点II结合的布洛芬分子模拟。
分子模拟的参数设置如下：体系温度采用V-rescale算法20，压力采用Parrinello-Rahman算法21。远程范德华力(VDW) nm，静电相互作用采用Partical Mesh Ewald(PME)算法22， nm。采用
LINCS算法23固定共价键，相对偏差为10－4。 ps，每隔10 ps取一次坐标和能量值。非键能量用g_energy模块计算，其中LJ-(SR)和Coulomb-(SR)分别代表范德华能(ELJ)和静电作用能(ECoul)，非键总能量(Etotal)为二者之和。
布洛芬与HSA晶体结构(PDB ID：2BXG)的分子动力学模拟步骤和参数同上，模拟时长为5 ns，计算二者的ELJ、ECoul和Etotal，并与随机分布的HSA-布洛芬模拟结果进行比较。
所有分子模拟均在曙光工作站A620r-G上进行。前15 ns，由于50个随机分布的布洛芬-HSA模拟体系较大，共有近70万个分子， ns/天；后期35 ns，单一布洛芬分子结合的模拟体系约有10万个分子，运算速度约1 ns/天。一个批次50 ns分子模拟总耗时约110天。
3 结果和讨论

首先将未结合小分子的1AO6与结合有布洛芬的2BXG两个HSA域IIIA结构进行比较，结果发现位于位点II空腔入口处的残基差异较大，如Supporting Information中图S2所示。对于1AO6，组成空腔入口处的残基为ARG410、LEU387、SER489和LYS414等四个残基，由于受ARG410残基阻挡，空腔入口较小；而对于2BXG，ARG410残基发生位移，增加两个残基ASN391和GLN390共同形成空腔入口，因此入口显著增大，有利于小分子的结合。
为了让本文布洛芬-HSA结合的分子模拟更加具有普遍性，以1AO6作为HSA的起始构象，探讨随机分布的布洛芬分子的自由结合过程。

分析50个随机分布于HSA周围的布洛芬分子在前15 ns分子模拟过程的运动轨迹，可以发现有6个分子结合到HSA表面，分别位于域IA(2个)，域IIIA(2个)和域IIIB(2个)，其中一个布洛芬分子从HSA位点II距离3 nm外开始接近并最终结合于位点II。比较上述6个布洛芬分子在14－15 ns之间的平均结合能，发现结合于域IA的一个分子和位点II附近布洛芬的结合能较大，绝对值大于200 kJ·mol－1，但前者波动较大，后者结合较为稳定。因此，后续以该布洛芬分子运动轨迹作为一种可能的位点II结合途径，进行系统分析。
对于结合于位点II的布洛芬分子，其与位点II中心的距离、结合过程的静电作用能、范德华能和总能量变化见图2。仔细分析该布洛芬分子进入位点II的运动轨迹和能量变化，可以发现布洛芬与HSA的结合过程可分为四个阶段：远程吸引、表面结合调整、进入位点II空腔和位点II稳定结合。 ns内，二者间的距离波动较剧烈，结合能较小， ns时静电作用能开始出现并持续增大，表明布洛芬分子受静电吸引而接近HSA表面，即第一阶段的远程吸引；－16 ns之间，距离略有波动然后稳定，相互作用能也相应持续负值增大后稳定在－200 kJ·mol－1左右，形成第一个能量稳定平台，即第二阶段的表面结合调整；16－18 ns之间，二者间的距离小幅持续增大，静电作用能发生突变，由－200 kJ·mol－1变化到－400 kJ· mol－1后回落至－250 kJ·mol－1左右，分析轨迹发现此阶段布洛芬分子进入HSA位点II的空腔；18 ns后，二者间的距离基本稳定，能量波动较小，最后平稳在更低的能量平台上，约－280 kJ·mol－1。以下具体分析四个阶段的动态结合过程。
：远程吸引
图2 Distance between ibuprofen and the center of Site II and the interaction energies of ibuprofen on to Site II of HSA
分子模拟的初始阶段(0－ ns)，开始时HSA和布洛芬分子没有明显接触，无明显的非键相互作用，静电作用能和范德华能基本为0。 ns左右，布洛芬分子已经接近HSA表面。从图3中可以发现，pH ，虽然HSA整个分子带有6个净负电荷，但是表面电荷分布不均匀，位点II附近存在明显的正电区域。分析表明，布洛芬分子带有负电荷，带正电的LYS545可通过与布洛芬分子羧基的静电吸引作用，将其“吸引”至HSA蛋白表面，因此静电作用能急剧增大。当布洛芬分子到达HSA表面后，位点II附近带正电的LYS541同时发挥作用，静电作用能持续增大，范德华能也逐步增大，促进布洛芬分子稳定结合于HSA表面。分析能量贡献，可以发现该阶段主要以长程的静电吸引力为主。
图3 HSA表面电势分布(pH ) Isopotential surface of HSAat pH and the position of ibuprofen molecule at different simulation time
：表面结合调整
该阶段(－16 ns)布洛芬分子已经结合到HSA域III的表面，不过在两个极性区域(域IIIB的LYS541/LYS545和域IIIA的ARG410/LYS414)之间波动，范德华能和静电能总体呈现逐步增大后趋于平稳。
分析该阶段不同氨基酸残基和布洛芬分子的静电相互作用能，发现4个残基最为重要，分别为ARG410、LYS414、LYS541和LYS545，均带正电荷，其中LYS541和LYS545位于域IIIB，ARG410和LYS414位于域IIIA，形成两个极性
正电区域。分别计算两个极性区域的静电作用能，结果见图4。可以发现，初期(－8 ns)主要由域IIIB的LYS541和LYS545控制，其中LYS545还可与布洛芬分子形成氢键(见图5(a))；后期(8－16 ns)由域IIIA的ARG410和LYS414主导，ARG410也与布洛芬分子形成氢键(见图5(b))。也就是说，布洛芬分子由域IIIB迁移到了域IIIA，接近位点II的空腔入口。该阶段范德华能贡献较大的残基为ARG410、 LEU407、 LEU394、 GLN390 和ALA406，其中疏水残基ALA406、LEU407和LEU394可与布洛芬的苯环发生疏水性作用；12 ns后，范德华能起主导作用为疏水残基LEU407和LEU394。从图2可以发现，6 ns时总结合能为－100 kJ·mol－1左右，6－16 ns期间持续负值增大，16 ns时达到－200 kJ·mol－1，说明经过局部调整达到了更有利于布洛芬结合的状态。此外，静电作用能和范德华能同步负值增大，表面静电和疏水相互作用共同促进了布洛芬分子的表面结合调整。
：进入位点II空腔