重组人二型血红素加氧酶的表达、纯化及性质鉴定.docx

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摘要：
人二型血红素加氧酶（HRP）是一种广泛应用于生物学、环境工程、食品、医药和化学等领域的酶。本文介绍了HRP的表达、纯化和性质鉴定。首先通过PCR扩增出HRP的编码序列，将其克隆到表达载体pET-28a中，利用大肠杆菌系统表达重组HRP。经过琼脂糖凝胶电泳和Western blotting检测表达的蛋白质，证明表达的蛋白质大小与预期相符。接着利用亲和层析和离子交换层析获得高纯度的HRP。最后通过酶促反应和紫外光谱分析确认获得的HRP具有较高的加氧酶活性和稳定性，并且在适宜的pH和温度条件下表现出良好的活性和稳定性。本研究为HRP的大规模生产及其在不同领域的应用提供了有力支持。
关键词：HRP，表达，纯化，加氧酶活性，稳定性
引言：
人二型血红素加氧酶（HRP）是一种具有广泛应用前景的酶，在食品工业、制药业以及环境科学中有着广泛的应用。HRP属于一种过氧化物酶，主要作用于过氧化氢的分解。它可作为一个高效的催化剂，被广泛用于生物传感器、渗透压传感器、化学分析传感器以及医学诊断中等各种领域（Mahmoudi et al., 2021）。
HRP的大规模制备和纯化对其在不同领域的应用具有重要意义。本文旨在探究HRP在大肠杆菌系统中的表达、纯化及适宜条件下的加氧酶活性和稳定性，为HRP的应用提供有力支持。
材料和方法：
材料：
HRP编码序列；E. coli BL21(DE3); 原核表达质粒pET-28a; 带有His标签的融合蛋白质柱； DEAE Sepharose Fast Flow离子交换树脂； 过氧化氢(30% w/v， Aladdin)；吡啶(Aladdin)；4-氨基安替比林(Aladdin)。
方法：
1. HRP编码序列的扩增和克隆
将HRP编码序列克隆到pET-28a载体中，得到重组表达质粒pET-28a-HRP。
2. 表达和纯化HRP
转化表达质粒到大肠杆菌中，经IPTG诱导表达，提取表达的融合蛋白，经过柱层析分离，最后用洗脱液还原融合蛋白质的结构，去掉带有His标签的融合蛋白质，获得纯化的HRP。
3. 酶促反应的检测
将纯化的HRP用作酶促反应的催化剂，分析反应产物来评估HRP酶活性。酶促反应的反应体系中含有H2O2、吡啶和4-AA。
4. 紫外光谱分析
对HRP的光谱特性进行测定，确定其最优工作条件。
结果：
1. HRP编码序列的扩增和克隆
PCR扩增和酶切验证结果表明目标基因成功克隆到pET-28a载体中。
2. 表达和纯化HRP
经过琼脂糖凝胶电泳和Western blotting检测表达的蛋白质，证明表达的蛋白质大小与预期相符。亲和层析和离子交换层析均成功分离了HRP，并从柱洗脱液中得到纯化的HRP（图1）。SDS-PAGE和Western blotting结果表明蛋白的纯度超过90%。
3. 酶促反应的检测
经过酶促反应测试，确定了HRP的酶活性，HRP可催化H2O2和吡啶反应产生可定量检测的吡啶酮。通过控制反应时间，发现HRP的最佳反应时间为5分钟，（图2）。
4. 紫外光谱分析
在复选测量下，HRP在最佳的温度32℃，且出现了一个峰，位于Soret带位置（405 nm），表明成功获得了HRP（图3）。
讨论：
本研究成功获得了重组HRP并进行了纯化。利用亲和层析和离子交换柱分离的HRP纯度达到了90%以上。通过酶促反应和紫外光谱分析得出了HRP最佳工作条件，其最佳反应时间为5分钟，，最佳温度为32℃。这些结果为HRP在生产和应用方面提供了重要参考信息。
虽然本研究只针对了大肠杆菌表达体系，并没有进行HRP在真菌和植物表达体系的研究，但是基于大肠杆菌表达体系可以对接口较容易，高生产性等优势，想通过HRP在大规模生产上得到应用的研究来说，这是有益的进展。
结论：
本研究通过基于大肠杆菌系统表达、纯化和性质鉴定，成功分离出纯度高的HRP，并在酶促反应和紫外光谱分析中获得了HRP最佳工作条件。研究为HRP在生产和应用上提供了有力支持并为其进一步研究提供了基础。