小片段基因组文库的构建.ppt

实验小片段基因组文库的构建
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基因文库
基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后,转化宿主细胞,并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合。
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根据文库所用的外源DNA的种类的不同
基因组文库
cDNA文库
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载体
把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子
(1)在宿主细胞内能独立复制。
(2)有选择性标记。
(3)有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
(4)分子量小,拷贝数多。
(5)容易从宿主细胞中分离纯化。
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常用的载体有5类:
3. 载体的种类
质粒(plasmid)
单链DNA噬菌体M13
噬菌体的衍生物
柯斯质粒(cosmid)
动物病毒(virus)
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基因组文库载体
P1噬菌体载体
cosmid黏粒载体
BAC载体(细菌人工染色体)
PAC载体(P1人工染色体)
YAC载体(酵母人工染色体)
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各种载体的比较
载体
容量(kb)
宿主
导入细胞方式
黏粒
30-45
大肠杆菌
转导
P1
70-100
大肠杆菌
转导
PAC
130-150
大肠杆菌
电转
BAC
120-300
大肠杆菌
电转
YAC
250-400
酵母
转化
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基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性。
N = ln (1-P ) / ln (1-f )
P是希望得到的覆盖率,
f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,
N是所需的克隆数。举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,
人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb,
希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N = ln (1 - ) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp])
= - / - x 10-6
= 138,298
文库克隆数的确定
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基因组文库构建的基本流程:
基因组DNA片段的制备
载体的制备
将基因组DNA片段连接入载体
将重组载体转入宿主细胞。
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载体DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应
2. 外源DNA片段的制备
总DNA分离纯化分离特定大小DNA片段
机械剪切法
酶法部分酶切
完全酶切
3. 供体与载体DNA连接
要提高重组频率,应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分
子的分子比率。
4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增
利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞,让其自主复
制,重组DNA分子被扩增(重组子比率可能发生变化)
5. 基因组文库质量的评价
1)文库规模----随机挑取一些重组子,提取质粒DNA,电泳测定插入片段大小,然后根据上述公式计算文库大小。
2)重组频率----频率越高,质量越高,可大大减轻后续筛选基因工作量。
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