小片段基因组文库的构建.ppt

实验小片段基因组文库的构建基因文库基因文库指某个生物的基因组DNA 或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后,转化宿主细胞,并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合。根据文库所用的外源DNA的种类的不同基因组文库cDNA文库载体载体把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子(1)在宿主细胞内能独立复制。(2)有选择性标记。(3)有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。(4)分子量小,拷贝数多。(5)容易从宿主细胞中分离纯化。常用的载体有5类:3. 3. 载体的种类载体的种类质粒(plasmid)单链DNA噬菌体M13?噬菌体的衍生物柯斯质粒(cosmid)动物病毒(virus)基因组文库载体?P1噬菌体载体?cosmid黏粒载体?BAC载体(细菌人工染色体)?PAC载体(P1人工染色体)?YAC载体(酵母人工染色体)各种载体的比较转化酵母250-400YAC电转大肠杆菌120-300BAC电转大肠杆菌130-150PAC转导大肠杆菌70-100P1转导大肠杆菌30-45黏粒导入细胞方式宿主容量(kb)载体基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性。N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数。举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3 x 109bp, 插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N = ln (1 - ) / ln (1 - [106bp / 3 x 109bp]) = - / - x 10-6= 138,298文库克隆数的确定基因组文库构建的基本流程:?基因组DNA片段的制备?载体的制备?将基因组DNA片段连接入载体?将重组载体转入宿主细胞。. 供体与载体DNA连接要提高重组频率,应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的分子比率。4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞,让其自主复制,重组DNA分子被扩增(重组子比率可能发生变化)5. 基因组文库质量的评价1)文库规模----随机挑取一些重组子,提取质粒DNA,电泳测定插入片段大小,然后根据上述公式计算文库大小。2)重组频率----频率越高,质量越高,可大大减轻后续筛选基因工作量。