PCR技术大攻略.doc

一、PCR技术及步骤
聚合酶链式反应(PCR)
PCR扩增产物的克隆 
上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。
二、PCR常见问题汇总 
1.  没有得到扩增产物 
 
(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 
 
(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。 
 
(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。 
 
(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。 
 
(5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。 
 
(6)使用PCR试剂盒时还应注意: 
 
①是否严格按照说明书操作; 
 
②试剂使用前是否充分混匀; 
 
③试剂储存过久或不当而失效。 
 
2.  扩增产物在凝胶中涂布或成片状 
 
(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。 
 
(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 
 
(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。 
 
(4)循环次数过多;增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。 
 
(5)退火温度过低。 
 
(6)电泳体系有问题: 
 
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大; 
 
②凝胶没有凝固好; 
 
③琼脂糖质量差。 
 
(7)若为PCR试剂盒则可能:  
 
①由于运输储存不当引起试剂盒失效; 
 
②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。 
 
(8)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 
 
3.  溴酚蓝前有区带(很宽) 
 
(1)模板量太低。增加模板DNA的用量。 
 
(2)循环次数太多。减少循环次数。 
 
(3)复性度偏低。提高复性温度。 
 
(4)预变性后没有立刻上机循环。 
 
(5)引物3'端是否互补;重新设计合成较长的引物。 
 
(6)引物用量偏多。降低引物的使用量。 
 
4.  扩增产物出现多条带 
 
(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 
 
(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。 
 
(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。 
 
(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。 
 
(5)样品处理不当。 
 
(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。 
 
(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
5.  PCR假阳性结果 
 
(1)引物设计不当,应调换引物。 
 
(2)循环参数不合适,导致非特异性扩增。 
 
(3)靶序列的交叉污染。
6.  PCR假阴性结果 
 
(1)引物长度不够。 
 
(2)试剂浓度不标准。 
 
(3)靶序列如突变、缺失等