我的论文中的实验方法.doc

第二章含6×His标签T7Select10-3b载体的构建
材料与方法
材料
实验材料及试剂
BLT5615 Novagen公司
T7Select10-3b噬菌体 Novagen公司
EcoR I/Hind III End Modification Kit Novagen公司
DNA Ligation Kit Novagen公司
T7Select10-3b Cloning Kit Novagen公司
DNase I TaKaRa 公司
β-Agarase TaKaRa 公司
TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit TaKaRa 公司
2000 bp DNA Ladder TaKaRa 公司
Taq DNA 聚合酶 TaKaRa 公司
IPTG AMRESCO公司
DNA纯化试剂盒庄盟公司
其他常用试剂:羧苄青霉素(Carb) 、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母菌粉、琼脂、琼脂糖、NaCl、甘油、PEG8000等为进口分装或国产分析纯。引物合成与测序由北京宝瑞通生物科技有限公司完成。
主要试剂配制
LB液体培养基:胰蛋白胨10g/L;酵母菌粉5g/L,NaCl 10g/L,pH
LB固体培养基:胰蛋白胨10g/L;酵母菌粉5g/L,NaCl 10g/L,琼脂15g/L,pH
LB半固体培养基:胰蛋白胨10g/L;酵母菌粉5g/L,NaCl 10g/L,琼脂15g/L,pH
50mg/ml羧苄青霉素溶液:Amp 1 g溶解于10mL蒸馏水中,过滤除菌,-20℃保存。
噬菌体提取缓冲液:20mM Tris HCl,pH ,100mM NaCl,6mM MgSO4
50×TAE电泳缓冲液:Tris ,冰醋酸5. 7mL, 0. 25mo1/L EDTA(pH8. 0) 20m1,
加蒸馏水至100mL,室温保存,使用时用双蒸水稀释至1×工作浓度。
1%琼脂糖凝胶:琼脂糖1 g,加入100 mL ×TBE溶液。
主要实验仪器
分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司,FA1104N
PH计上海任氏电子有限公司,6173
PCR仪 Whatman Biometra,T-Gradient
电泳仪北京六一仪器厂
自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂,SZ-93
紫外/可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司,TU-1810
生物洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司,BCN-1360B
手掌型离心机海门市麒麟医用仪器厂,Lx-100
高速冷冻离心机 sigma,2-16K
液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司
电热恒温水浴锅北京市永明医疗仪器厂,DZKW-D-2
电热恒温干燥箱黄石市医疗器械厂,72-1
隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂,PYX-DHS
Fluor-S凝胶成像系统美国Bio-Rad公司
超低温冰箱海尔公司,-86℃ ZKU-L200 Eppendorf管若干(、50ml),移液枪枪头若干(10μL-1000μL)
方法
T7Select10-3b宿主菌的培养
T7Select10- BLT5615,加甘油存于-80℃中。
初代培养
向20mL无菌LB液体培养基中加入20μL 50mg/mL carb,摇匀后接入200μL BLT5615,用含有20μL 50mg/mL carb的20mL无菌LB液体培养基做空白对照。于37℃,220rpm摇床过夜培养。
继代培养
1)向300mL无菌LB液体培养基中依次加入300 μL 50mg/mL carb和2mL过夜培养的菌液。用只含有
20μL 50mg/mL carb的20mL LB培养基做空白对照。于37℃,220rpm摇床培养。
2),以空白培养基为对照测量菌液600nm波长下的吸光度,。加IPTG至终浓度1mmol/L,37℃继续摇床培养30min,得宿主菌悬液(-1)。
T7噬菌体的扩增
1)向培养好的宿主菌悬液中加入100μL T7Select10-3b噬菌体原液。继续37℃,220 rpm摇床培养,使宿主细胞裂解。用不加T7噬菌体原液的宿主菌液做空白对照。,瓶内产生丝状沉淀。3-4h,丝状物增多,溶液比以前澄清,裂解完毕。
2)向裂解液中加入12μL 5