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改善RNA提取质量的十大要点
【字体:大中小】:2008年8月20日0 来源:生物通
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摘要: RNAse的无处不在导致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的质量,专注RNA的Ambion公司专家为你介绍在RNA纯化过程中要特别注意的10个问题。另外还有Ambion荣誉产品超级促销信息!
ABI供稿,生物通翻译
在收获组织及细胞死亡之后,应立即灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解。
    以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:
1)用含离液(如
胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。
2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活
3)立即将样品置于RNAlater™ Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(< cm),这样RNAlater才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。
 
使用正确的细胞或组织储存条件
    在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。
    RNAlater使样品储存更为便利。储存在
RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期,在4°C可稳定保存长达1个月,或永久保存在-20°C。有关RNAlater的更多信息请参考 hlib/resources/RNAlater.
 
彻底匀浆样品
    细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁,就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型,哪些方法是最适合的匀浆方法,请参考 hlib/tb/.
 
在RNA提取之前预处理样品裂解液
    对于某些样品来说,在匀浆之后,RNA提取之前,还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织,像脑组织和脂肪组织得到的裂解液,就需要通过氯仿抽提来去除脂类,从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖,会降低RNA的质量和产量,用Plant RNA Isolation Aid 预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。
 
选择最好的RNA分离方法
    现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离,如RNAqueous™或RNAqueous-4PCR Kit。因为操作简单,所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织,如富含核酸酶(胰腺)或脂肪(脑和脂肪组织)的样品,就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法,如ToTALLY RNA™。更多的信息请参考 hlib/tn/83/ 。更多方法选择,请参考 hlib/trees/RNA/
 
DNase处理
    如果提取的RNA将用于RT-PCR,我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织,如脾脏时,DNase处理也是一个好办法。Ambion的RNAqueous-4PCR Kit的实验流程中包含了DNase处理的步骤,并提供了必需的试剂(DNA酶I)。DNA-free™ DNase treatment & Removal Reagents 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I,优化的反应缓冲液,和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法,无需使用有机溶剂和热处理。
 
减少环境RNase的暴露
    为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RN