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复旦大学
硕士学位论文
氨基酸同位素标记、新型纳米材料等在蛋白质组学中的应用
姓名:水雯箐
申请学位级别:硕士
专业:分析化学
指导教师:陈先;杨芃原
20040512
摘要第三章将新型无机纳米材料——硅基介孔分子筛应用于蛋白质的酶解复旦土学硕士论文人类基因组计划提出了对生物体系进行系统性分析的新概念。后基因组时代,应运而生的蛋白质组学即在蛋白质水平上大规模研究基因产物及其在细胞内的功能。虽然蛋白质组学与生物、医学的交叉研究已取得丰硕成果,但众多技术难题成为阻碍其进一步前行的瓶颈。因而,每一项新技术、新方法的提出都可能拓展、深化以蛋白质组学为策略的生命科学研究。本论文以生物、化学、材料科学的交叉融会为背景,提出和发展了若干适用于蛋白质组学的新策略、新器件,对现有的以生物质谱为核心的技术平台进行改进和优化,从而为生物体系的蛋白质组表达谱研究和疾病相关的差异蛋白质组研究提供更合理、高效的技术工具。本论文由四部分组成。第一章首先概述了蛋白质组学最新的技术进展,并重点介绍了氨基酸同位素代谢标记的定量蛋白质组学,以及以疾病蛋白质组学为手段研究肝癌的发生与转移的现状。该章节的第二节概述了各类纳米材料作为新型载体对生命科学技术发展的推动和启示,并突出了有序的硅基介孔材料在该领域的应用价值和潜能。第二章将氨基酸同位素标记与生物质谱技术相结合,用于肝癌细胞的蛋白质组学研究。首先,辅助的肽从头序列分析的策略被应用于串级时间飞行质谱—疶淄嫉慕馕觥R恢指伟┫赴档牡鞍字首槭状斡闪街种柿标签分别标记肽段碎片中的末端和内部残基。这种联合标记的策略显著增强了疶谱图的信号特异性,使研究者能轻易的指认某些商用软件和其他标记方法无法辨别的肽段序列。辅助的从头测序方法还被用于解析质量较差的疶谱图,这对于可靠的鉴定弱信号/低丰度的蛋白质具有极其重要的意义。同时,本工作探讨、优化了针对肝癌细胞系的代谢标记效率和定量方法,从而在实验室原有基础上建立起整套基于的定量蛋白质组学的技术路线,初步用分析,获得了许多令人振奋的发现和成果。酶解是大规模分析蛋自质混合物的关键步骤。本工作首次展示了介孔孔道的限制空间内蛋自酶解效率显著提高的现象;并给与一定的理论解释。我们还考察了介孔材料的宏观结构、表面性质与酶于不同转移潜能的肝癌细胞的差异表达研究。解效率之间的关系,从而合成了结构、性质优化的纳米孔材料用于下一步的蛋白质组分析。
复旦去学硕士论文本章工作首次将一种三维有序的纳米孔阵列材料一魑5鞍字实牟集器和反应器。报道了蛋白质底物在该纳米限制空间内的结构去折叠现象。这种生物大分子的构象变化被拉曼光谱直接证实。我们构建的这种“奇异”的纳米反应器表现出对蛋白的快速酶解、蛋白鉴定的高灵敏度和酶固定化的种种优势定性增强、重复使用、反应物与产物易于分离屎铣晌5鞍字首檠芯康囊恢新工具。我们还利用此纳米反应器对实际生物样品进行分析,取得了远优于常规方法的结果。本章的工作展示了规则有序的介孔空间的独特特性,为分子水平的反应器设计提供了新载体、新思路,也启示了纳米材料在生物大分子的结构性质第四章展示用平头不锈钢喷针可实现持续稳定的纳升流电喷雾。首次揭装置和集成该喷针的微流控芯片,在标肽和蛋白酶解产物的质谱分析中均表现出良好的性能。另外,本章工作设计制作了一种末端细长的玻璃喷头,以插入金属丝来导电。这种成本极低的玻璃纳喷头与质谱相接后,成功鉴定了二维凝胶分离得到的实际蛋白质点,可成为实验室内简单生物样品质谱分析的配套工具。关键词:蛋白质组学,氨基酸同位素标记,硅基介孔材料/分子筛,肽从研究中的巨大潜力。示了材料的表面润湿性质影响喷雾的相关机理。用该喷针制作的一种简易电喷雾头序列分析,串级时间飞行质谱,差异表达研究,酶解,纳米限制空间,结构去折叠,纳升流电喷雾
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,以大规模分析细胞或生物体内的蛋白质为主要任务的蛋白质组研究成为后基因时代的重要研究内容;其研究与分析的范围已迅速扩展至一系列生命科学的热点领域,包括蛋白质组作图,基因的产物识别和功能鉴定,细胞周期、肿瘤发生发展等重要生命活动的分子机制,新型医药靶分子、肿瘤恶性标志物的寻找和分析,等等S捎谘芯慷韵蟮母丛有裕绕涫嵌低丰度蛋白质的检测难度,蛋白质组学所必需的高灵敏度、高分析通量和速度使得传统的生物化学方法远远不能满足要求。而生物质谱技术的发展,尤其是适合生物大分子的电离方法的变革,使在乃至水平检测几十万甚至上