基因克隆的一般流程.ppt

基因克隆的一般流程
基因的获得
PCR
RT-PCR
载体
连接
准备感受态细胞
转化
重组子筛选
下游工作
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载体的选择
基因工程载体一般要求:
能在宿主细胞中复制繁殖,有较高的自主复制能力。
易进入宿主细胞,进入效率越高越好。
合适的多克隆位点(MCS)可接受外源片段,且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。
易从宿主细胞中分离纯化出来, 便于重组操作。
有筛选标志,当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。
常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等
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重组 DNA 技术的一般流程
目的DNA的获得
目的DNA与载体的连接
重组子导入受体细胞
重组子的筛选和鉴定
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实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
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NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: a GAGCTC agt
NGF-antisense: at agagtgtctg
5
6
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pEGFP 荧光质粒表达载体
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质粒DNA的酶切反应结果
质粒 M 酶切反应 M 酶切反应
pEGFP pT-NGF
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酶切产物凝胶回收操作步骤(Gel Extraction Kit)
仔细切下含DNA的凝胶,。称重。
按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液,置50℃水浴10分钟,使凝胶完全溶化,每2分钟颠倒混匀一次。
将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱,置收集管中,9000g×30秒,倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入同一收集管中。
在吸附柱中加入500l W1溶液,9000g×15秒,倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。
将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。
,在吸附膜中央加入30lddH2O,静置1分钟,9000g×1分钟。备用。
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重组子的筛选
耐药性基因
外源质粒赋予宿主抗生素抗性
蓝白斑筛选(互补现象)
lacZ+ plasmid 和 M15△ cell strain
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