[硕士论文]BPOZ基因剔除小鼠模型的建立及BPOZ基因功能的研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
BPOZ基因剔除小鼠模型的建立及BPOZ基因功能的研究
姓名:项佑贵
申请学位级别:博士
专业:分子遗传学
指导教师:王铸钢
20040501
嘲’缩略词上海第二医科大学博士学位论文狢,一,珽珽Ⅸ,—猅甆狶狶——珿一————
中文摘要,,提示可能有重要的生物学功能。在卵巢癌组织中的表达降低,抑癌基因可诱导表达升高。能抑制肿瘤细胞生长,转染并稳定表达的结肠癌细胞生长变慢,细胞周期的谘映げ⒂忻飨缘腉疭转变延缓。因此可能是一个参与信号传导通路的细胞生长或肿瘤抑制基因。基因剔除窃谛∈笳水平研究基因在生物体内δ艿囊恢种苯佑行У姆椒āN颐悄馔ü基因剔除技术建立基因缺失小鼠,通过对基因剔除小鼠的表型分析来研究基因缺失对小鼠生⒂蜕砉δ艿确矫娴挠跋欤约癇胫琢基因第宰佑腥植煌艚有纬桑颐且苍谘芯恐锌寺〉紹十一内含予一种未见报道的剪接形式。为保证对基因所有剪接形式的完全灭活,本研究设计的基因剔除方案敲掉启动子和第一外显子以外的其余全胞克隆显微注射后获得嵌合体小鼠,嵌台体小鼠传代获得杂合子/一痛合子唬小鼠。半定量和蛋白印迹实验证实一/一小鼠没有基因的表达,从而在偷鞍字仕街っ鰾蛱蕹迪至硕訠虻完全灭活。基因剔除小鼠生殖和发育正常,纯合子小鼠存活至九月龄时尚没有肿瘤发生,基因与肿瘤的关系尚需更长时间的观察。病理检查发现基因剔除小鼠容易出现皮肤溃疡、肺炎和肠炎。基因剔除雄性小鼠常出现皮肤感染或溃疡,感染或溃疡的真皮下有大量的中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润,部分小鼠形成皮下脓肿或皮下表皮囊肿。肺炎和肠炎在三至四月龄以上的,锚蛋白重复虰—琓峁褂蜃槌伞和峁褂蚪榈嫉鞍紫嗷プ饔茫饬礁鼋峁发生的关系。部外显子。我们通过细胞基因打靶获得了同源重组的细胞克隆。该细说诙娇拼笱Р┦垦宦畚置鸈白由
基因剔除小鼠中非常常见,病理表现一般为肺组织淋巴细胞和浆细胞浸润,肺泡胞浸润,严重的肠炎有肠粘膜变性坏死。基因剔除小鼠常见脾脏和淋巴结萎缩,淋巴细胞减少,而非淋巴细胞增生,病变严重的小鼠脾脏和淋巴结的结构被完全破坏。部分一/一小鼠的脾脏和淋巴结的生发中心扩大,浆细胞多见。基因剔除小鼠初步的免疫细胞表面标记的分析发现三月龄小鼠的未成熟和成熟馨拖赴壤珻和馨拖赴壤蹷细胞和总赴谋壤为明确不同异构型对细胞生长的影响是否一致,我们构建了拔颐鞘状慰寺〉降腂旃剐偷恼婧吮泶镏柿#直鹱H竟卑〩细胞进行细胞克隆形成实验。无峁褂虻腂对细胞克隆形成的抑验说明不同异构型对细胞生长的影响因细胞类型的不同而有差异。入、裸鼠荷瘤、细胞周期分析等一系列实验来评价细胞的增殖能力。进一步的实验发现一/一赴裁飨陨ぜ趼唬幌赴け渎长上起双重作用:即一定水平的维持细胞的正常生长,但在高表达时抑制细胞的生长。同源蛋白侨菀妆环核鼗到獾牡鞍住N颐茄芯糠⑾諦鞍也不稳定,抑制实验证明通过泛素化一鞍酌柑逋揪督到狻等含峁褂虻鞍卓尚纬葿’—的泛素连接酶复合体并介导特异的靶蛋为阐明是否介导特异靶蛋白的降解及其作用机理,我们研究了和嗷ソ岷系慕峁褂蛞约癇煌峁褂蚝徒榈壁增厚,严重的肺炎可导致肺泡塌陷和肺实性变。肠组织也常见淋巴细胞和浆细制作用与喾隆5H救伺呱鯤赴螅挥蠦明显抑制细胞克隆形成,可见不同异构型对细胞生长的影响是有差别的。以上实为探讨基因剔除对细胞生长的影响,我们采用细胞生长曲线、剀詹实验结果均证明一/一细胞的生长变慢,细胞周期分析发现有/谧柚汀结果说明可能是细胞正常生长过程中的必要组分。可能在调节细胞生白泛素化降解。提示也可能形成泛素连接酶复合体介导特异的靶蛋白降降解的关系。首先我们用蛋白体外结合实验证实能与结合,激未见明显异常。解。上海第二医科人学博士学位论文
光扫描共聚焦显微镜观察发现蛋白与蛋白在细胞内共定位,说明在体内和体外均能与相互结合。体外结合实验发现截去薃结构域的与不再相互结合,但截去薆结构域的仍能与结合,说明通过峁褂蛴隕岷稀=囟痰腂隕谙赴诘共定位实验进一步在细胞的水平验证了体外结合实验的结果。此后,细胞共转染实验发现蛋白伴随蛋白的降解而降解。截去结构域或峁褂虻腂隕沧:驟鞍撞槐唤到猓得鰽和结构域均是介导的降解所必需。截去峁褂虻腂鞍撞荒苡结合,因而不能介导的降解。峁褂蛩淙徊皇荁隕慕合所必需,但推测峁褂蚴荁隒纬蒃核亓用杆匦琛=厝峁褂虻腂鞍姿淙荒苡隕岷希ú荒苡隒纬蒃核亓用织中蛋白水平。蛋白印迹发现一/一小鼠组织中蛋白水平降低,的功能非常广泛,但与免疫系统的关系尚很少报道。基因剔除小鼠出现的免疫缺陷表型可能主要并非因为影响到的功能,推测体内有细胞周期或白细胞分化发育相关的功能更重要的蛋白作为的靶蛋白。找出这些蛋白对于研究基因缺失所致免疫功能障碍的机理至关重要。综上所述,我们通过基因剔除技术建立了基因剔除