25923青霉素结合蛋.doc

25923青霉素结合蛋.doc25923青霉素结合蛋
论文关键词青霉素结合蛋白苯唑西林亲和力
论文摘要利用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、25923青霉素结合蛋白的亲和力。结果发现金葡球菌有5条青霉素结合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范围41~87kD。25923的PBP1和PBP2亲和力强,尤其是与PBP2亲和力很强。由此说明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。
青霉素结合蛋白(penicillin-bindingproteins,PBPs)是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他β-内酰胺类抗生素螯合的细菌蛋白质,即是抗生素作用的靶位点,抗生素与这些靶位点结合后,干扰细菌细胞壁肽聚糖合成而导致细菌细胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)对金葡球菌具有强大的抗菌作用,对其作用机制的研究,国内未见报道。本文应用微生物生化研究方法,25923中提取细菌内膜蛋白,采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、荧光放射自显影术及竞争分析法,25923细胞内膜青霉素结合蛋白的亲和力,探讨苯唑西林杀菌作用的分子学基础。
1 材料和方法
药品及试剂
苯唑西林为国家暂行标准品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)为Sigma公司产品; -青霉素G钾,比活性Bq/mmol,英国Amersham同位素公司产品;十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 为Sigma公司产品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司产品;二甲基亚砜(DMSO),重庆化学试剂厂产品;X光片为美国Kodak公司产品。
实验仪器
超声粉碎机(Virsonic 300型),美国Vir-tis公司产品;超速低温离心机Beckman L8-60,美国Beckman公司产品;直立式电泳仪,北京六一仪器厂生产;凝胶吸干器(gel slabdryer),英国Bio-Rad公司产品。
菌株
25923,获自中国科学院菌种保存中心。
研究方法
增菌
将金葡球菌接种于M-H肉汤()25ml中,37℃恒温振荡(速度150~200r/min)孵育16h,再转移至250ml新鲜预热的M-H肉汤中继续振荡4h。于10
℃,8000×g离心10min收集菌体,用50mmol/L PBS()洗涤1次,称湿菌量可达1~2g。
细菌细胞内膜蛋白质的制备
参照文献[1]并作改进。将湿菌悬于2倍体积的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(,含10mmol/L MgCl2、-巯基乙醇、 DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中进行超声粉碎(60s破碎+60s间隔,强度14kHz,共6次),在显微镜下观察细胞破裂情况。7000×g,4℃,离心10min去除未破碎细胞。上清液于100000×g,4℃,离心50min使细胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巯基乙醇)混匀,放0℃30min,