氯霉素及盐酸克伦特罗残留ELISA检测方法研究1.docx

College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhej iang University,Hangzhon 3 1
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摘要
摘要
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一种广谱高效的抗菌剂,它可以和大多数药物和饲料添加剂混用,在喂养过程中稳定,药效不会降低。由于该类药物的广泛使用,使其在动物源性食品上的检出率越来越高,氯霉素在食品中残留会引起严重的后果,如可能抑制人体骨髓造血功能从而引起再生性障碍性贫血症等。
而盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride,CL)是一种B2一肾上腺素受体激动剂。最初在l临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。因其具有改变动物的营养代谢,降低胴体脂肪,提高瘦肉率,同时使动物增重,提高饲料使用率的作用被不法商人用于做饲料添加剂。:人类食用超过盐酸克伦特罗残留限量的肉后会出现心悸、肌肉震颤、呕心呕吐、发热寒战等I临床症状,特别对心脏病、糖尿病、高血压等病人危害更大。
因此,研究用于氯霉素和盐酸克伦特罗的ELISA检测试剂盒,对于保护消费者利益, 对于食品安全检测以及国际贸易有重要的意义。本研究对盐酸克伦特罗和氯霉素的人工抗原的合成以及ELISA检测方法的建立等进行了研究,得出如下研究结果:
盐酸克伦特罗和氯霉素分别与载体蛋白一牛血清白蛋白(BSA)通过重氮法合成了免疫抗原,经紫外、蛋白电泳实验证明半抗原与载体蛋白偶联成功,同时使用相同方法与载体蛋白卵白蛋白(OVA)合成了包被抗原。
合作单位用合成的免疫抗原制备了氯霉素鼠单抗,盐酸克伦特罗兔多抗,用合作单位制备的氯霉素鼠单抗,盐酸克伦特罗兔多抗对氯霉素间接竞争ELISA检测方法进行了研究,得到上述ELISA检测方法的灵敏度、线性范围、线性拟合并对检测步骤、检测时间等因素进行了优化,结果显示较合适的检测条件为:鼠单抗使用浓度为稀释1600倍,包被抗原稀释100 倍并且4℃包被12小时可获得较好的试验结果。其他条件通过优化实验,最终选择最佳包被时间为4℃12h,一抗最佳作用时间为60min,二抗最佳作用时间为60min,底物作用时间为15rain。对底物配方进行优化,得到1MB和H202的最佳组合为450 p LIMB(IOmgTMB溶于 2mLDMSO)+5 p L的H202。用优化后的间接竞争ELISA检测方法测得氯霉素最低检测限
,接近到欧盟法规(EC—decisions 2003/181/EC and 2004/25/EC)规定的
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释100倍后,包被时间为41212h。其他条件通过优化实验,最终得到一抗最佳作用时间为 60rain,二抗最佳作用时间为40rain,底物作用时间为15,nin。对底物配方进行优化,得到 TMB和H202的最佳组合为400 i1 LTMB(10mgTMB溶于2mLDMSO)+7 u L的H202。用优化后的直接竞争ELISA检测方法测得盐酸克伦特罗最低检测限l,52ng/mL。
关键词:氯霉素,盐酸克伦特罗,多克隆抗体,ELISA
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Abstract
Abstract
Chloramphenicol(chloramphenicol,CAP)is a broad—spectrum antibiotic to Gram—positive and negative a resuR of abusing residue problem a