薄荷内生真菌对薄荷生长及挥发油影响的研究-生药学专业毕业论文.docx

摘要
薄荷是一味常用中药,味辛,性凉,归肺、肝经,可散风热,清头目,利咽喉,透疹,止痒。薄荷在医疗,工业及农业上具有广泛的应用,挥发油是其重要的物质基础。薄荷挥发油质量的稳定性不但影响其在中医临床上的疗效,还会影响其相关产品的质量。对影响薄荷挥发油的环境因素(气候、土壤、地势等) 研究比较多,并且发现薄荷挥发油因地理位置差异而呈现不同的化学型。本文从微生态角度进行研究,从薄荷植株中采用纯培养技术分离纯化得到两株内生真菌 DSF-K 和 DSF-B,考察对薄荷生长及挥发油的影响,并做一些理论上的探讨。
对外来薄荷的传入进行历史进行考证,发现薄荷是我国一个本土植物,在唐以前作为食用不为药用。当时有记载的波斯薄荷有三种,其中两种有明确的种名。而《食性本草》所记载的胡薄荷是从朝鲜传入中国的。
对不同种、不同地区、不同品种的薄荷挥发油进行研究。发现α-pinene、β-pinene 及 eucalyptol 是薄荷挥发油中的主要组成成分,也是共性成分,在四种薄荷(亚洲薄荷、水薄荷、皱叶薄荷及薄荷)挥发油中常见。亚洲薄荷(Mentha arvensis L.)共检测到鉴定到 56 个成分。主要特征成分为 pulegone 和 piperitone oxide。水薄荷( L.)共检测到 47 个成分。特征成分为 menthofuran。薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)共检测到 84 个成分。3-octanol,trans –β-ocimene 及 carvone 为其特征性成分。皱叶薄荷( cv.)共见到 62 个成分。主要有 D-Limonene, Eucalyptol。
根据薄荷萜类物质的生物合成途径,结合主要挥发油成分对薄荷化学型进行界定和划分的方法,对所收集的薄荷进行化学型的划分。薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)的挥发油具有产地依赖性,江苏产薄荷为胡薄荷酮型;云南产薄荷为香芹酮型;河北、广西产产薄荷为柠檬烯-桉油素型。水薄荷( L.)为呋喃薄荷型;皱叶薄荷( cv.)为桉油素型;亚洲薄荷为氧化胡椒烯酮-胡薄荷酮型。并选择以氧化胡椒烯酮-胡薄荷酮为主要特征成分的亚洲薄荷为研究对象。
首次对亚洲薄荷(Mentha arvensis L.)的内生真菌进行系统纯培养分离研究。
从亚洲薄荷健康的茎和叶中共分离得到 101 株内生菌,亚洲薄荷内生真菌在数量
和种类上有着极其丰富的多样性特征。半知菌纲所包含的五个目中均有不同种类的真菌被分离出来。从分离到的内生真菌数量上来看,在目的分类水平上以丛齿梗孢目(Moniliales)为优势种群,该目共有菌株 79 株,占总菌株数的 %; 在属的分类水平上以拟青霉属(Paecilomyces)、轮枝孢属(Verticillium)、黑团孢属(Nigrospora)、叶点霉属(Phyllosticta)、枝顶孢属(Acremonium)为优势种群, 包含菌株分别为 12 株、8 株、7 株、9 株、9 株,占总菌株数的 %、%、 %、%、%。
对亚洲薄荷内生真菌 DSF-K 和 DSF-B 的生物系统学研究,发现 DSF-K 应属于半知菌亚门(Fungi imperfecti) ,丛梗孢目(Moniliales) ,丛梗孢科(Monilialiaceae),枝顶孢属(Acremonium)。DSF-B 属于子囊菌门(ycota)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)。并在常规培养下,观测菌株的生长发育特点,观测菌落颜色,质地等,利用电镜扫描观测菌丝、分生孢子梗及孢子的特征。根据两株菌的 rDNA ITS 序列设计特异性引物,设计出各自特异性引物,用来检验接种情况。利用染色及内生真菌回接分离试验考察内生真菌在植物体内的定植及生长情况。
对亚洲薄荷组织培养研究,亚洲薄荷愈伤组织最佳诱导条件为 MS+6-BA( mg/L)+NAA( mg/L)+2,4-D( mg/L)。最佳的生根培养为 1/2MS+IBA( mg/L)+NAA( mg/L)。后期继代用 1/2 MS,植株生长良好。
首次接种两种内生真菌考察对薄荷生长及挥发油的影响。
DSF-K 和 DSF-B 接种亚洲薄荷组培苗,研究内生真菌对薄荷生长及挥发油的影响。研究发现 DSF-K 抑制亚洲薄荷的生长,而 DSF-B 能促进亚洲薄荷的生长。同时接种两株内生真菌的组培苗与接种单一菌株的 DSF-B 无明显差别,反映两株菌的交互作用,相互拮抗而显示对植物生长无显著性影响。
接种 DSF-K 和