杜氏盐藻完整叶绿体分离和叶绿体转化体系构建.pdf

杜氏盐藻���������完整叶绿体的分离和叶绿体转化载体的构建中文摘要曲东京郑州大学细胞生物研究室,郑州大学生物工程系随着转基因研究的不断深入,人们将越来越多的研究兴趣集中在生长迅速,培养简单的单细胞绿藻上。利用单细胞绿藻进行遗传转化有其优越性,与传统的格的培养条件,具有光合自养、培养成本低,易于转化等优点,是一类比较廉价目前,对单细胞绿藻的转化工作主要集中在两大方向:细胞核转化和叶绿体转化。经过数十年的发展,植物的核转化技术�槌墒觳⒌玫搅斯惴旱挠τ茫��是核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的内在问题:如由于核基因组而在叶绿体转化系统中却可以克服这些困难。与核转化相比,叶绿体基因组位点,能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿体中��肿佑卸喔隹奖矗��币堵烫宥员泶锊�锏幕�塾薪锨康某惺苣芰Γ�保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外,由于叶绿体基因组的原核性质,对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达,而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入,并由共同的启动子控制,硕士研究生导师薛乐勋郑州,河南���微生物发酵、动物细胞和转基因动物等转化系统相比,它不需要昂贵的设备和严和安全的生物反应器。大、背景复杂、易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象;所表达的原核基因必须经过修饰改造,环境安全难以保证等。小,遗传操作简单,外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点,可以将目的基因定位在适于表达的既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因郑州人学��年颂�学位论文丰�涎瘟菽洗慷纫堵烫宓奶崛『蚽�烫遄;�仄偷墓菇�
杜氏盐藻�韵录虺坪赵�是一种低等的单细胞真核绿藻,属绿藻门绿藻纲约�����释衷残位蚶嫘危�芤揽科渌ū廾�谒�杏味�9饩迪驴擅飨钥吹�其内含一个大型的杯状叶绿体,约占细胞总体积的�%。可在���一���暮�藻可在高渗盐溶液中生长,这是许多其它生物难以生存的环境,故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置,可以直接采用开放式培养,大大降低生产成本,由于没有细胞壁可很容易的用基因枪,电击法等一系列转化方法进行遗传转基于叶绿体转化的优越性以及盐藻的独特性,本实验意欲在盐藻中实现稳定高效的叶绿体转化。在我们以前的实验中,初步的盐藻叶绿体转化系统已经构建成功,但是由于用于重组的同源片段长度不足使得得到的转化系统不太稳定。本实验首先分离大量完整的叶绿体,进而抽提高纯度叶绿体�����,利用四个平端酶随机切割���⒘�咸匾焐杓频慕油������菇ㄋ母鲆堵烫�基因组步行文库,通过巢式��┰龅阶愎怀ざ鹊耐�雌�危���菇ㄒ堵烫�实验方法��卧逋暾�堵烫宓姆掷爰癱��的提取上,对��液体培养液进行了部分改良,如将��的浓度调至�。度离心得到完整的叶绿体。采用优化的��畃������环樱�确拢�煳齑挤桨赋�提得到高纯度的������卧錭���蛭粗2嘁砬�睦┰���被选择用于我们进行叶绿体转化的同源片段。它和��、��参与编码光非依赖性的原叶绿素酸醋还原酶���,任何一个基因的破坏都阻断黑暗条件下叶绿素的合成。��基因插入失活后,盐藻还可通过光依赖性的原叶绿素转化无法做到的。团藻目,进化树分析显示其与具有细胞壁的莱茵衣藻十分相似,没有细胞壁,长水中生长,最佳生长繁殖盐度为�.�,目前已知最耐盐的真核生物。由于盐化,这些独特使得杜氏盐藻可被开发为一种生产药用蛋白的良好宿主。转化载体。在进行盐藻叶绿体的分离时,从某种程度上讲对其大量高效的培养显得至关重要。合适的培养条件一方面可以使细胞快速增殖,另一方面则可以保持整个生长过程中叶绿体保持良好的形态。我们在比较了不同的盐藻生长的培养基的基础取对数生长后期的杜氏盐藻细胞进行高压破碎,利用差速离一��驼崽敲芏忍�郑州人学��年坝�貉�宦畚�札氏黼凛一矗�度叶绿体的提取和叶绿体转化裁体的构建�
酸醋还原酶系统���完成叶绿素的合成,而不影响转化藻的正常生存。��赫藻叶绿体基因组步行文库的构建端限制酶切,之后和特异的接头连接制成叶绿体基因组步行文库,作为巢式��通过在��基因上游设计特异引物,在制成的叶绿体基因组步行文库中进����基因未知下游侧翼的扩增同样,通过在��基因下游设计特异引物,在叶绿体基因组步行文库中进��卧逅ń换灰堵烫遄;�靥宓墓菇ḿ白;�峁�某醪郊��在新增同源片段的基础上,对已有的叶绿体转化载体进行改造,构建成盐藻叶绿体转化载体���猙�以用于叶绿体转化。用电击转化法转化野生型盐藻实验结果��卧逋暾�堵烫宓姆掷爰案叽慷萩��的制备证实了所得叶绿体的完整性。�デ碇�悄�旱缬炯觳鈉��,并用紫外分光光度仪检测���呐ǘ群痛慷龋�峁�允荆�樘岬降腸�