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HPLC使用操作和注意事项
HPLC流程简图:
流程
流程:如右图所示,溶剂贮器(1)中的流动相被泵(2)吸入,经〔3〕梯度控制器按一写的梯度进行混后然后输出,经(4)测其压力和流量,导入(5进样阀(器)经(6)保护柱、(7)分离柱后到(8)检测器检测,由(10)数据处理设备处理数据或(11)记录仪记录色谱图,(12)馏分收集器收集馏分,(13)为废液。.
操作步骤
排空状态:将吸液头让在已经超声的甲醇中,旋松排空阀让机器以高流速排走机器或输液管的气泡,3—5分钟后关闭排空阀,排空结束。
冲洗状态:以适当流速冲洗机器核色谱柱大约20分钟;同时开启检测器,让检测器处于预热和自检状态。
联机状态:打开联机电脑让色谱工作站和HPLC机器相连设定吸收波长,适当流速,查看系统压力是否正常。
用已经配好的流动相换下甲醇开始走基线,此过程大约20分钟
当基线平稳,开始进样准备。
进样前用进样液清洗六通阀2-3次。
样品打入机器开始谱图。
谱图完成清洗机器和关闭电脑:用甲醇做流动相以适当流速开始冲洗机器大约15分钟,确定甲醇已经充满机器管道。同时用甲醇清洗六通阀若干次。退出色谱工作站和关闭电脑。
整理数据填写结果。
注意事项
1、进样前样品处理及注意事项
(1)须用专用平头液相专用注射器进样(禁用气相尖头进样针);
(2)进样试液应无颗粒、浑浊和乳化,使用前先用超声波溶解后, 的过滤膜过滤;
(3)部分装取样时,取样体积一般小于定管的50%,完全装液相取样体积取必须是定量环的5 倍以上
2、操作中注意事项:
1). 流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2) 柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。
3) 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4) 压力不能太大,最好不要超过150kgf/cm2 .
5) 因为缓冲试剂遇有机溶剂,会结晶,有损色谱柱,所以,每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。
6) 温度是影响HPLC的压力重要原因之一,所以尽量保持恒温。