细胞基因敲除--crispr-cas9技术流程.pdf

CRISPR/Cas9技术基本流程


基因组编辑(Genome Editing)步入 Cas9 的时代



专业的 CRISPR/Cas9 介导的 knock-out 和 knock-in 就
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-58603268 南京尧顺禹 CRISPR/Cas9 技术基因改造专家
南京尧顺禹—CRISPR/Cas9 技术专业服务公司
一、CRISPR/Cas9 技术介导的基因敲除和敲入
1、基本原理
CRISPR/Cas9 靶向基因改造(敲除、敲入)技术是最新发展起来的
一种强有力的用于基因组编辑(genome editing)的分子生物学工具,
现已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、
拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的
遗传学改造。相较于 TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)技术,
CRISPR 技术的效率要高得多,而且采用 CRISPR 技术可以一次性的对
多个基因同时进行基因敲除和/或敲入(Science, 2013, 15 February, p. 823)。而
先前担心 CRISPR/Cas9 技术的脱靶问题,最近已有美国马萨诸塞州坎
布里奇博大研究所(Broad Institute in Cambridge, Massachusetts)的合
成生物学家张丰(Feng Zhang)通过使用带有点突变的 Cas9 完全解决(Cell.
2013 Sep 12;154(6):1380-9 )。美国哈佛大学的 e Church 认为,
CRISPR/Cas9 技术的高效率和易用性将是其它已有基因组改造技术包
括 TALEN 等所无法匹敌的(Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6)。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats),即成簇规律
间隔的短回文重复序列。Cas9 蛋白是一种能够降解 DNA 分子的核酸
酶( nuclease),其中含有两个酶切活性位点,每一个位点负责切割 DNA
双螺旋中的一条链。CRISPR 在大约 40%的细菌和 90%的古细菌
(archaea)的基因组中均有存在,它依赖 crRNA (CRISPR RNA 能够与 tracrRNA
配对,形成双链 RNA 结构,这种双链 RNA 分子能够介导 Cas9 核酸内切酶对与双链 RNA 分
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-58603268 南京尧顺禹您的 CRISPR/Cas9 技术基因编辑专家
子互补结合的 DNA 序列进行切割) 和 tracrRNA (trans-activating chimeric RNA, 即反式激
活嵌合 RNA,一种非编码 RNA,能够促进 crRNA 的形成,是 Cas9 蛋白发挥 RNA 介导的 DNA
切割作用必不可少的辅助因子)对外源 DNA 进行特异的识别,然后使用 Cas9
对外源 DNA 进行序列特异性地切割降解,从在细菌和古细菌细胞发挥
了一种获得性免疫的作用。利用这一细菌获得性免疫的工作原理,美
国加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)的生化学家
Jennifer Doudna 研究团队将 tracrRNA 和空格 RNA(spacer RNA)组合起
来,形成一个所谓的“向导 RNA”分子(single-guide RNA:sgRNA),然后将
其与 Cas9 蛋白混合在一起,成功地对特定的 DNA 位点进行了切割
(Science , 17 August 2012, p. 816)。由于 sgRNA 是通过其中的 20 核苷酸特异
识别目标基因,设计起来非常方便,因此,在这一里程碑式的研究论
文发表后,CRISPR 技术得到了迅猛的发展。自 2013 年 1 月起,大量
的有关利用 CRISPR 技术的文章发表在 Science、Nature 和 Cell 上,形
成了一个 CRISPR 热潮。由于 CRISPR 系统是以 RNA 作为基因组定位
工具,而 ZFN(锌指核酸酶)和 TALEN 核酸酶则都是以人工组装的特异
性 DNA 位点结合蛋白作为基因组定位工具,用 ZFN 和 TAELN 技术
需要好几个月的实验结果,用 CRISPR 技术只需要几个星期就可以拿
到(Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6)。