实验大蒜细胞SOD的提取和分离.doc

实验大蒜细胞SOD的提取和分离.doc:..实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗袞老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2_)进行歧化反应,生成氣和过試化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含冇较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后,!11。由于SOD不溶于丙酮,可川丙酮将其沉淀析出。SOD酶活性测定原理:核黄素在冇氧条件下能产生超氧自由®负离了•()厂,当加入氮蓝四唑(NBT)后,在光照条件下,与超氣A由基反应生成一种蓝色物质,在560nm波长下有最人吸收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H’结合生成出02和02,从而抑制了NBT光还原的进行,。通过在反应液屮加入不同景的SOD酶液,光照一定吋间后测定560rw波K下各液光密度值。二、 :(1).新鲜蒜瓣(2). /L磷酸缓冲液()(3):氣仿-乙酚混合液:氣仿+无水乙酚#(4).丙酮:用前需预冷至4-10°:(1)(Met)磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸(C5HnNO2S,MW=),,,充分混匀(现用现配)。4°C冰箱中保存4用1〜2d。(2)'4mol/LNBT溶液准确称取NBT(C^OCl^ioOe,MW=),用少量蒸馏水溶解后,移入250mL容呈瓶巾用蒸馏水定容至刻度,充分浞匀(现配现用)。4°C冰箱中保存可用2〜3d。(3):准确称取EDTA(MW=292),用少量蒸馏水溶解。B液:准确称取核黄素(MW=),用少量蒸馏水溶解。C液:合并A液和B液,移入lOOmL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,^imol/L核黄素溶液。4°C冰箱屮保存可用8〜10〔1。该溶液;、V避光保存,即用黑纸将装冇该液的棕色瓶包好,置于4°C冰箱中保存。当测定SOD酶活吋,将C液稀释100倍,%iol/L核黄素溶液。三、实验步骤1、 组织细胞破碎:称取10g人蒜蒜瓣,置于研鉢屮研麽。2、 SOD的提取:破碎后的组织中加入4倍体积(40ml)(),继续研磨15min,使SOD充分溶解到缓冲液中,取一半体积于8000〜lOOOOrpm卜‘离心10min,另一半55-601热处理150^1后离心,取上清液,。3、 险杂蛋D:-乙醇合■液-搅扑15min,500Qrpm尚心15min,得到的上淸液为粗酶液。4,SOD的沉淀分离:粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,8000〜lOOOOrpm离心l