实验23 大蒜细胞SOD的提取和分离.doc

【实验目的】通过大蒜细胞SOD的提取与分离,学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。【实验原理】超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应,生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后,。由于SOD不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有2.-未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROD)、烷氧自由基(RO)等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸(VC)、VE和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.-、H2O2、。SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn--SOD,它们可催化下列反应:2.-2.-O+O+2H+SOD→HO+O222HO+CAT→HO+1/2O22222.-由于超氧自由基(O)为不稳定自由基,寿命极短,测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O,当加入NBT后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月替(黄色),继而还原生成二甲月替,它是一种蓝色物质,在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值,抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比,以酶液加入量为横坐标,以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标,在坐标纸上绘制出二者相关曲线,根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时的酶量作为一个酶活力单位(U)。【器材与试剂】一、器材恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、()3、氯仿-乙醇混合液:氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮:用前需预冷至4-10℃5、()6、、2mmol/L肾上腺素溶液【实验步骤】1、组织细胞破碎:称取5g大蒜蒜瓣,置于研钵中研磨。2、SOD的提取:破碎后的组织中加入2-(),继续研磨20min,使SOD充分溶解到缓冲液中,