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实验大蒜细胞SOD的提取和分离
实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定
一、实验原理
超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应,生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后,。由于SOD不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出。
SOD酶活性测定原理:核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2,当加入氮蓝四唑(NBT)后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成一种蓝色物质,在560nm波长下有
+最大吸收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还
原的进行,使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值。
二、材料和试剂
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(1). 新鲜蒜瓣
(2). /L磷酸缓冲液()
(4). 丙酮:用前需预冷至4-10℃
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(1) mol/L 蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液
准确称取L-蛋氨酸(C5H11NO2S,MW=), mol/L , mol/L ,充分混匀(现用现配)。4℃冰箱中保存可用1~2d。
(2) × 10-4 .-mol/L NBT溶液
准确称取NBT(C4OH3OCl2N10O6,MW=),用少量蒸馏水溶解后,移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀(现配现用)。4℃冰箱中保存可用2~3d。
(3) EDTA的2 × 10 mol/L核黄素溶液
A液:准确称取EDTA(MW=292),用少量蒸馏水溶解。
B液:准确称取核黄素(MW=),用少量蒸馏水溶解。
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C液:合并A液和B液,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度, EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8~10d。该溶液应避光保存,即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好,置于4℃冰箱中保存。
当测定SOD酶活时,将C液稀释100倍, EDTA的2 × 10mol/L 核黄素溶液。三、实验步骤
1、组织细胞破碎:称取10g大蒜蒜瓣,置于研钵中研磨。
2、SOD的提取:破碎后的组织中加入4倍体积(40ml)(),继续研磨15min,使SOD充分溶解到缓冲液中,取一半体积于8000~10000rpm下离心10min,另一半55-60℃热处理15 min后离心,取上清液,。
4、SOD的沉淀分离:粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,8000~10000rpm离心10min,得SOD沉淀。