实验一细胞形态多样性及细胞计数.ppt

【实验目的】了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态;掌握细胞计数的基本方法。实验一细胞的形态观察和细胞计数【实验原理】1、细胞形态观察根据体外培养细胞在培养时,是否能贴附于支持物上生长,可将其分为贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长,一般有两种形状,即表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。大多数细胞是贴附型生长的。当细胞贴附在支持物上后,细胞的形态失去它们在体内时的原有特征,在形态上表现单一化的现象。此细胞形态与体内成纤维细胞的相似而得名,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质向外伸出2~3个长短不齐的突起。细胞在生长时呈放射状火焰状或旋涡状走行,除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间充质起源的组织细胞常呈此形态。成纤维细胞型上皮细胞型 本型细胞呈扁平不规则多角形,中有圆形核。细胞彼此紧密相连成单层膜,生长时呈膜状移动;处于上皮膜边缘的细胞总与膜相连,很少脱离细胞群单独活动;起源于内、外胚层细胞如皮肤表层、消化层上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。此型细胞在支持物上散在生长,一般不连接成片,细胞质经常伸出伪足或突起,呈活跃的游走或变形运动。此型细胞不很稳定,有时亦难和其它型细胞相区别,在一定条件下,如培养基化学性质变动等,它们也可能呈成纤维细胞形态。游走细胞型有一些组织和细胞,如神经组织的细胞等,难以确定他们规律和稳定的形态,可通归入多形细胞型。多形细胞型悬浮型有的细胞在培养时不粘附于支持物上,而是呈悬浮生长状态,如某些癌细胞和血液白细胞。 细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长,能繁殖出大量细胞。 培养细胞形态的分类,主要是根据细胞在培养中的表现以及描述上的方便而定。它可受很多因素的影响而发生变化。当细胞处于较好的培养条件时,形态上有相对的一致性,在一定的程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别。但培养条件是很难控制的,难免不发生变化。如CO2浓度,培养液的PH,支原体的产生,包括细胞接种密度等,都会影响细胞形态。悬浮型和贴附型的性质也不是一成不变的。在一定条件下,悬浮型细胞可呈贴附状生长。由于培养细胞形态的易变性,在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些变化时,应参考多方面指标,必要时应利用电镜来提供形态学依据。sp2/::复苏后12小时;:倒置显微镜X20;:DMEM+6%FBS;:细胞呈圆型或椭圆形。培养细胞形态分析贴壁细胞在生长状态良好时,胞体细长、胞浆清亮,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚,细胞长成单层时呈漩涡状排列;悬浮细胞当表现出边缘清楚,透明发亮时,生长较好;反之,则较差或已死亡。在细胞机能状态不良时,细胞轮廓会增强,反差增大;细胞内颗粒较多,透明差,空泡多。若细胞胞体肥大、胞浆内混浊、颗粒增多、折光性下降、变扁平透明,细胞核明显增大、细胞排列极不规则则,细胞可能已经衰老。培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好;呈淡黄色时,则可能是培养时问过长,营养不足,死亡细胞过多;如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。当细胞生长状态良好时,培养液应清澈透明,悬浮的细胞和碎片很少。当瓶内培养基混浊时,应想到细菌真菌污染的可能。实际上,一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。1、细胞形态观察(l)将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度,然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上,此时应注意不要将瓶翻转,也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。(2)打开倒置镜光源,通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。(3)调节粗调旋钮调整物镜的高度进行对焦,在看到细胞层之后,再用细调节器将物像调清楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构,在观察时,最经常使用的是10X物镜。【实验内容】