溶组织内阿米巴培养.doc

第一节寄生虫的人工培养一、溶组织内阿米巴培养可分有菌培养(ulture)和无菌培养(ulture)(一)有菌培养主要用Robinson’s培养基,不仅可以培养溶组织内阿米巴,也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用6ml~7ml或更小的螺旋有盖培养管。:(1)盐水琼脂斜面:溶解15g琼脂粉和7g~8g氯化钠于1000ml蒸馏水中,分装在小试管中高压灭菌(121℃,15min),当琼脂冷却至75℃左右倾放使其形成斜面。(2)红霉素:,加入20ml70%乙醇溶解,4℃放置2h以上,而后加灭菌水至50ml。(3)米粉:梗米粉经高压消毒或180℃干燥灭菌。(4)配制50mmol邻苯二甲酸氢钾,,高压灭菌。(5)血清:56℃30min灭活,甚至未灭活的牛或马血清均可使用。(6)R溶液贮存液:NaCl50g(NH4)(90%纯度)4ml,加水至950ml,,最终调节容量至1000ml,分装高压灭菌,制备成贮存工作液。使用时将100ml贮存液加入850ml双蒸水,。(7)BR溶液:25mlR工作液与1个克隆的大肠杆菌,37℃振摇培养48小时。(8)BRS溶液:在上述BR溶液中加入等量血清,继续培养24~48小时即可。、120ml红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液4:1混合液,加入少量(约50mg)粪便,混匀,37℃培养24小时后,移去培养上清液,加适量入4:1混合液并加入60ml红霉素和米粉。37℃继续培养48小时后,取米粉与粪渣混合物一滴,以碘液染色或直接观察有无滋养体;若未发现虫体再加入米粉,再培养24小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养,即为转种。(二)无菌培养最常用是BIS-33培养基,为液体培养基。培养在6ml的玻璃有盖培养管中,由于阿米巴为兼性厌氧代谢,故应紧盖管盖,并呈5°的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高,甚至水质也会影响其生长,并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功培养虫体。BIS-33培养基含三个组分,即营养液、维生素混合液、成牛血清。(1)营养液:~半胱氨酸~,酵母提取物30g溶于600ml双蒸水中,,最终容量调至870ml,分装,高压消毒后,冷却至-20°贮存。(2)维生素培养液有多种,如下一种是最易配制的。溶液A:烟酰胺45mg;盐酸维生素B64mg;泛酸钙23mg;盐酸硫胺5mg;,均溶于双蒸水,定容至25ml;溶液B:核黄素7mg()加双蒸水至45ml;溶液C:()加双蒸水至45ml;溶液D:d-生物素2mg,加双蒸水至45ml;溶液E:DL-6,8-硫辛酸1mg,溶于5ml95%乙醇中,加入500mgTween80并定容至200ml,,4℃暗处保存。(3)成牛血清成牛血清需经4小时左右灭活方可用于培养,但需避免反复冻融。(4)完全培养剂营养液87ml,成牛血清10ml或15ml,维生素混合液2ml,混合,冷藏,随时可用。应用6ml的螺旋有盖培养管,36±℃培养,72~96小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与37℃的BIS-33培养基混匀,使米粉等粗颗粒自然沉淀,取含滋养体的上清液通过滤纸,400g2min离心,弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、卡那霉素、多粘菌素的BIS-33培养液中,并加入数滴福尔马林固定的短膜虫,在6ml螺旋有盖培养管中培养。24小时后可见滋养体贴附试管壁,换一次培养液,继续培养48小时或72小时后转种,使其逐渐转为无菌培养,并可进一步克隆化。二、阴道毛滴虫培养可分有菌培养和无菌培养。。一般应用12ml或6ml的螺旋有盖培养管,可从病人阴道后穹隆取材直接放入培养管中,加入青霉素1000u/ml,链霉素1mg/ml,以除去杂菌,36±℃培养。具体配制方法为,取小牛肝脏60g,清洗粉碎,浸入400ml蒸馏水中,4℃过夜。而后煮沸1小时左右,纱布过滤,最终调节容量至400ml,分装,4℃贮存。,~,,20分钟高压灭菌,使用前加入15%灭活牛血清。2