实验双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的



原理:物质的电子结构不同,所能吸收光的波长也不同,这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度,对物质进行定性和定量的分析方法,常用紫外—可见分光光度法。
光的电磁波性质

射线
x射线
紫外光
红外光
微波
无线电波
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm cm 10cm 103 cm 105 cm
可见光
分光光度法
定性分析与定量分析的基础
物质对光的选择吸收
A

在一定的实验条件下,物质对光的吸收与物质的浓度成正比。
A

C
增大
定性分析基础
定量分析基础
I0
I
参比
样品
入射光 I0
透射光 I
一束单色光通过溶液介质后,光能被吸收一部分,吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。
在一定的实验条件下,物质对光的吸收与物质的浓度成正比。
Lambert—Beer定律
A=εCL
T(透射比)=I/I0=10-CL
lg(1/T)= CL
A为吸光度;ε为吸收系数;C为溶液浓度;L为溶液光程的厚度
应用
(1)比较吸收光谱曲线
(2)比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm,
核酸的最大吸收波长为260nm。(3)比较吸光度的比值

纯DNA

配制一系列不同浓度的标准溶液(至少5个)按测定管同样方法处理显色,在选定的波长分别测定各管的吸光度(A),以吸光度为纵坐标,标准溶液的浓度(C)为横坐标,制作标准曲线。
根据样品的A从标准曲线上查得样品含量,再计算出样品的浓度。
常用方法
标准系列
未知样品
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。
2. 标准管法
CX/AX=CS/AS,已知CS,测定AS、AX,可求得CX。
3. 摩尔吸光系数法
C=A/(为L=1cm,C为1 mol/L时的吸光系数,也称为摩尔吸光系数。)
分光光度计的使用