微小隐孢子虫重组BCGCP156023疫苗的构建及其保护性研究（可复制论文）.pdf

山东省医学科学院
硕士学位论文
微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗的构建及其保护性研究
姓名:李瑾
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:黄炳成
20080501
微小隐孢子虫重组狢疫苗的构建及其保护性研究中文摘要专业:病原生物学研究生:李瑾导师:黄炳成芯吭年发现的另一种虫种——∈笪赋Φ内发现的,它是一种属于顶端复合物门的寄生性原虫。隐孢子虫有很多种类,孢子虫后,虽可引起急性腹泻,但常为自限性:免疫力低下、功能缺陷或免疫感染此虫后,则可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻,导致大量体液丢失而危及生命,该病已被确定为引起人腹泻的六大病因之一。在艾滋病患者中感染率高达%左右,长期的严重腹泻,是艾滋病病人的重要致死因素之一。该虫致病力较强,小剂量ジ腥炯亮縄缥个卵囊奈⑿∫咦映媛涯足以引起健康自愿受试者感染。由于隐孢子虫卵囊体积微小本、分布广泛,常规氯化饮水消毒方法不能将其杀灭,故对人类公共卫生造成很大威胁。国外暴发流行时有报告,多发生于病人或病牛接触后的人群,或幼儿园和托儿所等集体单位。发生在美国威斯康星州芏只的那次暴发中,据估计超过余万居民染上了水样腹泻,致死嗳耍:非常大。因此,隐孢子虫病成为目前各国重点研究的寄生虫病之一。我国自年南京报道首例隐孢子虫病以来,江苏、浙江、安徽、福建、内蒙古、云南、四川、山东及上海等省市均已证实有该病存在,其感染率为%%不等。其有效虫种有余种,对人和大多数脊椎动物造成感染的主要是于子虫病且恢秩蛐缘娜诵蠊不技纳娌 UH烁腥疽抑制的患者缬び锥滩』颊摺⒂Q涣颊摺⑵鞴僖浦埠蟆⒅琢龌颊叩
自从发现隐孢子虫以来,许多研究者一直致力于该病的防治研究,但迄今为止,对该病尚无有效的防治措施,因此对该病的早期诊断、治疗以及研究防治该病卡介苗是用来预防结核病的牛型结核分枝杆菌减毒活疫苗,以卡介苗为载体的基因重组卡介苗因其具有集疫苗与佐剂于一体的特点,在免疫功能的研究、传染病和肿瘤的防治中均发挥了重要作用,成为近年来研究的热点。本研究利用分子生物学技术,将编码表面抗原和/的基因构建在同一穿梭质粒表达载体上,转化咝П泶顲融合蛋白,对重组蛋白进行纯化和鉴定;并用重组苯用庖咝∈螅鄄斓剿艽碳せ宀生特异性抗体和细胞因子,具有较强的免疫原性,为重组狢呙的应用奠定了基础。本研究的主要方法、结果及结论⑿∫咦映娑锬P偷慕⒓捌渎涯业姆掷氪炕方法:在饮水中加入地塞米松磷酸钠注射液痬抑制/∈免疫功能,灌胃接种微小隐孢子虫卵囊×觯使小鼠感染,收集小鼠粪便,用改良抗酸染色法确定感染成功,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊。用∈痛炕穆涯遥尤隓糜螅湃液氮中保存。结果:成功建立了微小隐孢子虫感染的/∈蠖锬P停惺笛樾鼠均感染,从接种炱鹣蛱逋馀懦雎涯遥桓牧伎顾崛旧ǚɡ堵躺ū尘跋旅倒红色的卵囊清晰可见;不连续蔗糖密度梯度离心法获得了大量纯度较高且有活力的卵囊,适合于免疫学和分子生物学使用。结论:微小隐孢子虫感染动物模型的成功建立及高纯度卵囊的获得,为隐孢子虫的传代及后续的分子生物学和免疫学的研究打下了基础。⑿∫咦映姹砻婵乖瑿颉复合基因载体的构建及鉴定方法:将纯化的微小隐孢子虫卵囊×加入裂解液后在液氮中反复冻融危梅右宦确鲁樘岱ㄌ崛∥⑿∫咦映媛涯业幕蜃镈。根据ǖ赖腃蚝虲蛐蛄械目7哦谅肟蚣芊直鹕杓坪铣梢的疫苗就显得尤为重要。、
N⑿∫咦映嬷刈轸訮王沪疫蓖免疫保护性的研究结论:成功构建了重组表达质粒刺一/,并成功将其转化至方法:籅痗小鼠,按每组只随机分为椋恐恍∈笪簿猜物;ɡ┰鯟蚱危薪捍看炕厥昭桑直鸾ǘ呖寺基因片段克隆至柿#菇ǔ蓀一柿#缓蠼ǘ结果:提取微小隐孢子虫基因组琍扩增出预期的片段及重组表达质粒和—/—。测序结果表明:与报道的基因序列相比,基因有黾罨煌贾个编码氨基酸发生改编码氨基酸发生改变,但都没有改变原序歹的开放阅读框架。⑿∫咦映嬷刈锽吨/呙绲墓菇ḿ凹方法:以—/一质粒为模板,┰鯟蚱危并克隆至张克隆载体将/蚱窝强寺≈罰穿梭质粒载体,构建成达,表达蛋白用初步分析;经过纯化、复性后的重组抗原用结果:┰鲦赵て诘腸抟,成功构建了籘—/一以及重组表达质粒弋>扔盏己蟊泶被兔抗隐孢子虫多克隆抗体识别。校V刈锽弋疫苗的研究打下了基础。注射双、、蛞/各甀,含王至克隆载体籘;通过酶切、测序鉴定正确后,将基因片段亚克隆至载体,构建成质粒:再将/者分别转化大肠埃蓑菌伐。和/片段怀晒菇藀飌柿#变,并且比原序列多出了黾罨籆蛴个碱基不同,导致结论:成功构建了和—/一重组表达质粒。。通过酶切、测序鉴定正确后,一/~重组质粒,用电穿孔法将其转化至小H扔盏际蛊浔分析鉴定。出了约娜诤系按眩炕蟮闹刈榈白跃璚分析鉴定证实能个细菌哉兆槲狿,共免疫危看渭涓周,于每次免疫后苤刈
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