纤维素酶酶活测定.doc

纤维素酶活测定方法原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖,具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、,以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。二、实验试剂羧甲基纤维素钠(聚合度1700-2000),内切纤维素酶(苏柯汉)50mmolNaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶(1000ml×2、500ml×3、100ml×4、50ml×4ml)、移液器、烧杯(500ml×3、50ml×3)、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制表1、葡萄糖标准曲线管号0123456葡萄糖溶液(ml)(ml),沸水浴5min,定容至25ml,测OD540nmOD540nm以葡萄糖含量为横坐标,以吸光度OD540nm为纵坐标,做标准曲线。五、-,-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。1、样品的制备CMC-Na溶液的制备:-%的CMC-Na(羧甲基纤维素钠)溶液,准确称量CMC-,,溶于蒸馏水中,45℃水浴锅中搅拌溶解,冷却后定容至100ml。纤维素酶液的制备:准确称取纤维素酶,。用50mmolNaAC-,-。DNS法测酶活:%CMC-Na的溶液于25ml具塞刻度试管中,55℃预热10min左右,,于55℃水浴锅中保温30min后,然后加2mlDNS,混匀,沸水浴5min,冷却至室温,定容到25ml。混匀测OD540nm。空白对照用酶活的酶液作对照。结果计算纤维素酶活力(U/g)=r×Df×1000/:r:通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度(μg/ml);:木糖的相对分子量,g/mol;t:酶解反应时间,min;Df:稀释倍数:酶活力的计算值要保留三位有效数字。苏柯汉公司给定的酶活计算公式为:纤维素酶活力(U/g)=r×Df×2×1000/V式中:r:通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度(μg/ml);V:实验时移取的酶液体积,;2:时间换算,30min的倒数为2;Df:稀释倍数:酶活力的计算值要保留三位有效数字。六、最适温度在最适pH的条件下,选择一系列温度梯度,分别在30、40、45、50、55、60、65、70、℃下按酶活测定方法测定酶活,确定最适温度。七、温度稳定性在最适pH条件下,将纤维素酶溶液在一系列温度梯度中保温72h,前6h每小时测一次酶活,6-10h每2h测一次,之后12h测一次。看纤维素酶活变化。纤维素酶的分离纯化实验试剂:NaAC、HAC、NaCl实验方法纤维素酶的分离纯化上样缓冲液