口腔鳞癌组织差异蛋白组学研究-口腔临床医学(颌面外科)专业毕业论文.docx

口腔鳞癌组织差异蛋白组学研究口腔临床医学研究生:赵晶 导师:马洪教授摘 要目的:运用蛋白质组学相关技术对口腔鳞癌组织及正常口腔黏膜组织中差异表达蛋白进行研究,为口腔鳞癌的诊断和治疗提供有价值的实验室依据。方法:收集口腔鳞癌组织及正常黏膜组织各10例,提取蛋白质,进行双向凝胶电泳,经图像分析软件分析识别差异表达,应用液相色谱—质谱分析鉴定差异蛋白质。结果:±17个蛋白/肽点,正常粘膜的双向电泳凝胶上可检测到198±20个蛋白/-3-3σ。结论:口腔鳞癌组织及正常口腔黏膜中蛋白质存在差异表达。本次实验发现14-3-3σ蛋白在口腔鳞癌中表达上调,其具体表达及机制有待进一步研究验证。关键词:口腔鳞癌;双向凝胶电泳;蛋白质组;质谱鉴定前 言口腔鳞癌(oralsquamouscellcarcinoma,)是发生在口腔黏膜的最常见的恶性肿瘤,约占口腔黏膜恶性肿瘤的97%,占头颈部恶性肿瘤的40%左右[1]。寻找敏感性高、特异性好的口腔鳞癌分子标志物,成为口腔鳞癌早期诊断的关键。在口腔鳞癌()发病机理的研究方面,从基因(DNA)和基因转录(mRNA)水平已进行了大量的研究[2,3],随着蛋白质组学的问世及其相关技术的不断发展与完善,肿瘤蛋白质组学研究已成为当今肿瘤研究的热点[4,5]。“蛋白质组学”(proteomics)是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科他从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用于联系,从而揭示蛋白质功能于细胞生命活动规律[6]。比较蛋白质组学的研究方法大部分研究集中在肿瘤方面的基础和临床研究上,涉及细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤的形成。通过此技术,可以筛选差异蛋白质,这些差异蛋白质可以成为研究肿瘤诊断和预后的分子标志物,也可以进一步成为研究治疗和药物开发的靶点。已有研究报道了在白血病、乳腺癌、肠癌、肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌等方面的应用,在口腔鳞癌方面的应用研究也在逐步展开。蛋白质组学中目前最常用的分离技术是双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)。2-DE是进行大规模蛋白质分离的最好选择,其基本原理:第一向使用固相pH梯度胶条(immobilizedpHgradients,IPG)进行等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,IEF),使蛋白质依等电点不同而分离。第二向是十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SodiumDodecylSulfonate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE),使蛋白质依分子量不同而分离。能够对不同样品或不同状态的蛋白质表达图谱进行对比,提供定量的信息。电泳后的凝胶通过染色,比较单个蛋白质点的染色强度,并进行定量分析。最常用染色方法有:考马斯亮蓝染色,银染色,荧光染色和放射自显影等[7]。本课题组前期研究工作取得了一定的成绩,通过比较口腔鳞癌组织与正常口腔黏膜间的蛋白质表达,发现了差异蛋白S100A7,S1000A8,S100A9在口腔鳞癌中高表达。本实验将继续用比较蛋白组学的方法,检测口腔鳞癌组织与正常口腔黏膜组织间的差异表达蛋白质,通过质谱鉴定技术,以期获得口腔鳞癌组织中特有的蛋白变化,为口腔鳞癌的诊断和治疗提供有价值的实验室依据。,未采用放疗及化疗且无其它口腔黏膜病、严重牙周病及全身性疾病;10例标本经贵阳医学院附属医院、贵州省人民医院及遵义医学院附属医院病理科确诊。其中高分化5例,中分化4例,低分化1例。男性8例,女性2例,年龄36-87岁,。选择正常口腔黏膜组织作为对照组。(urea)、磷酸、甲醇、冰乙酸、75%乙醇、乙腈为国产分析纯试剂。二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)、矿物油(Mineraloil)、考马斯亮蓝R-250、碘乙酰胺(iodoace-tamide)、丙基硫酸盐(CHAPS)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(N,N-)、硫脲(Thiourea)、琼脂糖、甘氨酸(Glycin)、IPGBuffer和IPG胶条(13cmpH3~10线性)、甘油(Glycerol)、溴酚蓝(BromophenolBlue)、过硫酸胺(Aps)、十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfate,SDS)、2D-cleanup试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒。⑴水化上样缓冲液:,,,超纯水定容至10ml。分装成10小管,每管1ml,-2