细胞生物学综合性实验报告.doc

植物原生质体的分离、纯化及融合引言原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下,分离的原生质体能合成新壁,进行细胞分裂,并再生成完整植株。分离原生质体采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用,而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组分,以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压,以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态,分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇,山梨醇,葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子,来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集,用蔗糖漂浮法纯既,然后进行培养。不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合,所产生的杂种细胞,即异核体经过培养可再生新壁,分裂形成愈伤组织,进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞,故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组,因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。人工诱导原生质体融合可使用物理学方法,如运用细胞融合仪,在电场诱因导下实现融合,然而至今广为使用的仍是聚乙二醇()溶液引起原生质体的聚集和粘连,然后用高钙溶液相处理的化学方法(等,)。该法应用分子量至为的聚乙二醇()溶液引起原生质体的聚集和粘连,然后用高的钙溶液稀释时,就产生了高频率的融合,融合的频率和省略常与所有的分子量、浓度,作用时间,原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。材料、试剂与方法材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。试剂.%酒精。.%升汞水溶液,并滴入少许。.灭菌蒸馏水。./和/·溶液,并加有%(吗啉已烷磺酸),。.%和%蔗糖溶液,。.酶液纤维素酶(,%果胶酶(,)(若用国产纤维索酶,则果胶酶可省去。)甘露醇/·/%.~..酶液纤维素酶()%离析酶()%半纤维素酶(,)%甘露醇/·% ~.,,用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。.将叶片在·%升汞溶液中浸泡灭菌,中间摇动几次。,用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上,小心用镊子撕去下表皮。.,每酶液约放叶片。若叶片不易撕下下表皮,可用锋利的解剖刀将叶片切成约宽的小条,放入酶液。.将培养皿用石蜡膜带封口,在℃条件下保温~,中间轻轻摇动~。在倒置显微镜下检查,直到产生足够量的原生质体。.,以除去未酶解完全的组织。.将滤液分装在刻度离心管中,用/的速度离心,使原生质体沉淀下来。.用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在/的·中。.用注射糙伸长针头向离心管生部缓缓注入%蔗糖溶液,在/下离心。此步完成后,在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带,杂质,碎片将沉到管底。.注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的·溶液。.离心管中留下的纯净原生质体用/的·悬浮。离心离心,吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。.