壳聚糖作为基因载体转染HEK293细胞的研究——蛋白质在真核细胞中表达定位研究初探.pdf

壳聚糖作为基因载体转染 HEK293
细胞的研究
——蛋白质在真核细胞中表达定位研究初探

(深圳大学,生命科学学院,生物技术专业任晰)
(学号:2000302042)

摘要:采用经修饰过的壳聚糖纳米材料作为转基因的载体,pGFP 作为报告基团基
因,将 pEGFP-N1 质粒与改性壳聚糖在溶液中混合,通过静电吸附得到壳聚糖/DNA 自组装
复合物。转染至 HEK293 细胞中,在 HEK293 细胞中能成功表达绿色荧光蛋白,用激光共聚
焦显微镜观察蛋白表达分布,初步认为绿色荧光蛋白于细胞质内表达。继而用本实验室自行
构建的 P Mob protein 质粒转染至 HEK293 细胞,用激光共聚焦显微镜观察,P Mob protein
主要分布在 HEK293 细胞的胞质中。
关键词:壳聚糖 pGFP-N1 质粒转染 HEK293 细胞 P Mob protein
教师点评:任晰同学在本实验室参加研究工作两年有余,熟悉细菌、细胞、分子生物学
等研究工作,有良好的实验素养,掌握了大量的生物学研究技术。尤其在壳聚糖纳米材料作
为载体转化基因方面做出了突出贡献。该同学实验严谨、敬业,思维活跃,表现出良好的科
研素养,科学、完整、系统地完成了一套的转基因研究工作,建立了一个比较好的技术平台,
为本研究的进一步工作打下了良好的基础。该研究的结果真实可靠,论文的写作比较规范、
严谨。另外任晰同学勤奋、进取,表现出良好的创新能力、协作能力和良好的人品。(点评
教师:刘士德,副教授)
在基因治疗中,把外源基因导入体内靶细胞时,必须借助于一个安全、稳定、转染率
高的载体。迄今为止,基因控释的载体分为病毒类载体(Viral vector)和非病毒类载体
(Non-viral vector)两大类。病毒类载体虽然转染率较高,但具有潜在的转染性和生产工艺复
杂等缺陷;非病毒类载体由于可以重复给药,较少引起免疫反应,具有储藏稳定,易于大规
模生产,对携带的 DNA 大小没有限制等优势,可作为一个较安全的新载体而倍受关注[1]。
壳聚糖(Chitosan)是一种天然的阳离子可生物降解多糖,作为比较理想的非病毒类基因
递送载体,具有以下的优越性:可以直接注射,稳定、无毒、无抗载体免疫反应;载体材料
可生物降解,与有机体有良好的生物相容性;控制基因释放,DNA 半衰期,延长基因表达
时间,增加基因药物疗效;可装载多种基因药物,也可以同时装载提高基因表达效率的添加
剂;靶向基因药物,最大限度的降低基因药物的副作用;保护基因药物,防止被血清中核酸
酶破坏;可以制成冻干粉针剂,容易保存,基因药物活性不受影响等[2]。
本实验采用深圳大学理学院应用化学系制备的改性壳聚糖作为基因转染载体,在体外观
察添加壳聚糖培养的细胞形态变化,并在细胞中成功表达绿色荧光蛋白,继而用激光扫描共
聚焦显微镜确定绿色荧光蛋白在细胞内分布情况。采用与上述实验流程相同的方法转染本实
验室构建的 P Mob protein 质粒,用激光扫描共聚焦显微镜观察蛋白质在细胞内的分布情况。
1. 材料与方法
材料
细胞株与质粒基因:HEK293 人胚胎肾细胞(本实验室保存);pGFP-N1 绿色