细胞色素C的提取.doc

摘要:细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质,包括多种能够传递电子的含铁蛋白质。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状,使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常,病情得到缓解或痊愈。在自然界中,细胞色素C存在于一切生物细胞里,其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜牛心为材料提取、制备和纯化细胞色素C,得到其粗品溶液,并进行含量测定。关键词:细胞色素C提取制备纯化含量测定1、原理:细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体,细胞色素C(cytochromec,CytC)只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合,仅有细胞色素C结合轻松,较易被分离纯化。细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质,每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000,蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成,其中赖氨酸含量较高,-,-%。它易溶于水,在酸性溶液中溶解度更大,故可用酸性水溶液提取。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应,故可分为氧化性和还原性,前者水溶液呈深红色,后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热,酸和碱都比较稳定,但三氯乙酸和乙酸可使之变性,引起某些失活。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状,使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常,病情得到缓解或痊愈。在自然界中,细胞色素C存在于一切生物细胞里,其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜猪心为材料提取制备和纯化细胞色素C,得到其粗品溶液,方法简单易操作。:新鲜(冷冻)猪心样品。①1mol/LH2SO4():500mL②1mol/LNH4OH():500mL③12%BaCl2:250mL④25%(NH4)2SO4:500mL⑤%NaCl:500mL⑥20%三氯乙酸(TCA):100mL⑦人造沸石:白色颗粒,40-60目⑧联二亚硫酸钠⑨细胞色素C标准液(3mg/ml):①绞肉机②电磁搅拌器③离心机④分光光度计⑤:,除尽脂肪、血管和韧带,洗尽积血,切成小快,放入绞肉机中绞碎(两遍)。:称取猪心碎肉200克,加自来水300毫升酸化水(水预先用6~8毫升,1mol/L的硫酸酸化)。用电磁搅拌器搅拌提取,再用1mol/L的硫酸调PH=(需要不断调整),。用1mol/L的氨水调PH=,停止搅拌。四层纱布挤压过滤,收集滤液。:用1mol/L的氨水调滤液PH=-,利用等电点沉淀杂蛋白,静置20~30分钟,使沉淀沉下。虹吸上部清夜,过滤除杂质,下部浑浊液离心(3000rpm,15min)。合并得到的红色清夜,测量体积。:每人称取人造沸石4g,加水搅拌,除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2