细胞色素C的提取.doc

实验目的掌握提取细胞色素C的原理。2、学习提取细胞色素C的操作技术。3、了解吸附法的原理和方法。实验原理细胞色素C是一种含有铁卟啉基团的蛋白质,是细胞色素的一种,在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间,是呼吸链的一个重要组成成分。细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。细胞色素C溶于水,在酸性溶液中溶解度更大,制品可分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定,但三氯乙酸和乙酸可使之变性,引起部分失活。吸附法指利用吸附作用,将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上,利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异,使目的物和其他物质分离,达到浓缩和提纯目的的方法。由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富,常以此为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为材料,经过酸溶液提取,人造沸石吸附,硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C。实验试剂和器材试剂1、2mol/L硫酸溶液2、1mol/L氨水溶液3、%氯化钠溶液4、25%硫酸铵溶液5、20%三氯乙酸溶液人造沸石猪心器材磁力搅拌器、组织匀浆机、层析柱、恒流泵实验步骤材料处理取新鲜或冷冻猪心,除去脂肪和韧带,用水洗去积血,将猪心搅成小块。提取称取碎猪心肌肉100g,放入500ml烧杯中,加蒸馏水200ml,搅匀,(此时溶液呈暗紫色),。提取完毕,,搅拌均匀,停止搅拌。用八层普通纱布挤压过滤;滤渣加入750ml蒸馏水,,两次提取液合并。(此时,,从溶液中沉淀下来),静置30—40min后过滤,所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。吸附与洗脱人造沸石容易吸附细胞色素C,吸附后能被25%的硫酸铵洗脱下来,利用此特性将细胞色素C与其它杂质蛋白分开。具体操作如下:人造沸石的预处理:称取人造沸石15g,放入500ml烧杯中,加水搅拌,用倾泻法除去12s内不下沉的过细颗粒。吸附:采用静态吸附法,搅拌吸附细胞色素C,使人造沸石逐渐由白色变为红色。装柱:连接洗净的层析玻璃柱,柱下端连接一乳胶管,用夹子夹住,柱中加入2cm左右蒸馏水,保持柱垂直,然后将已吸附细胞色素C的人造沸石带水装入柱中(吸附有细胞色素C的人造沸石先用自来水清洗,再用蒸馏水清洗至清,再用氯化钠溶液清洗3次,再用蒸馏水清洗至水清),避免柱内出现气泡。洗脱:柱装好后,打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的洗脱液(硫酸铵溶液)利用恒流泵将其泵入层析柱上口,使其通过人造沸石柱进行吸附。保持柱下端流速约2ml/min,收集含有细胞色素C的红色洗脱液,当洗脱液红色消失时,即洗脱完毕。盐析为了进一步提纯细胞色素C,在上面收集的洗脱液中,加入固体硫酸铵(按每100ml洗脱液加入20g固体硫酸铵的比例,使溶液硫酸铵的饱和度为45%)边加边搅拌,放置15~30min后,杂蛋白便从溶液中沉淀析出,而细胞色素C仍留在溶液中,用滤纸(或离心)除去杂蛋白,即得红色透亮细胞色素C溶液。6、三氯乙酸沉淀在搅拌情况下向所得透亮溶液加入20%三氯乙酸,细胞色素C立即沉淀出来(沉淀出来的细