实验报告细胞色素c的提取.doc

实验报告细胞色素C的提取一、实验目的1、熟悉细胞色素C提取与检测方法;2、掌握吸附、盐析、透析等实验技术。二、实验原理细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,分子量约为13000,肽链中含有19个赖氨酸残基,为一碱性蛋白,等电点(~)高、易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠,它是一种阳离子交换剂,细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。,它可与沸石分子上的钠离子发生交换,从而被沸石吸附。装入层析柱后,用25%硫酸铵洗脱,又可将细胞色素C交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度,主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合,必须严格控制三氯乙酸用量。三、实验仪器设备与材料试剂1、设备:组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱2、仪器:剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管3、试剂:联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵4、材料:新鲜猪心(2个)四、实验技术路线预处理     水、硫酸、     匀浆          提取液氨水、、过滤   氨水、、过滤滤液           人造沸石 水、氯化钠、硫酸铵      硫酸铵盐析洗脱液          滤液20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析细胞色素C粗品溶液五、实验步骤1、预处理:健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中(保护酶的活性,避免捣碎机破碎时使酶失活)—→放入生理盐水中清洗去污—→称重:烧杯80g,烧杯+猪心=240g,(240-80)×=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min(匀浆3min,停5min,为了保证捣碎机安全)2、提取:搅拌后静置2h—→,在过滤后静置2h—→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/,静置30min,过滤—→滤液加2mol/,静置30min,过滤3、吸附:加10%人造沸石(滤液为220ml)—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→%NaCI溶液洗3次—→滤出人造沸石待用4、洗脱:在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱,流速控制在2ml/min以下,收集红色的洗脱液(没分辨出红色液体阶段,收集了所有洗脱液)5、盐析:在洗脱液(300ml)中慢慢加入固体硫酸铵75g,边加边搅拌,使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤,收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液(过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4℃遇冷,边加边搅拌,加时要快,防止局部蛋白质变性)—→加完后分成8管,立即离心—→无明显沉淀,再5000转离心15min—→无明显沉淀,向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min—→无明显沉淀,实验结束6、透析 将上述溶解后的细胞色素C装入透析袋中,放进500ml烧杯中(用磁力搅拌器搅拌),用