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凝胶色谱分析
二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析
凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography, GPC),又称尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC),其以有机溶剂为流动相,流经分离介质多孔填料(如多孔硅胶或多孔树脂)而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱(GPC)的创立历程如下[2,5]:
1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质,观察到分子尺寸排除现象;1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品;1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料,以连续式高灵敏度的示差折光仪,并以体积计量方式作图,制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪,从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来,光散射技术(如图9-1所示,一束光通过一间充满烟雾的房间,会产生光散射现象。)广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱(GPC)分离技术相结合,可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数,也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前,该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具,在美国,日本及欧洲广为使用,国内近年来亦引进了此项技术。
入射光
散射光
图9-1光散射现象
基本原理
凝胶渗透色谱分离原理
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱,柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙(较大)和粒子内的通孔(较小)。如图9-2、图9-3所示,当待测聚合物溶液流经色谱柱时,较大的分子只能从粒子间的间隙通过,被排除在粒子的小孔之外,速率较快;较小的分子能够进入粒子中的小孔,通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后,不同相对分子质量的物质就被区分开了,相对分子质量大的在前面流出(其淋洗时间短),相对分子质量小的在后面流出(淋洗时间长)。从试样进柱到被淋洗出来,所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后,溶质的淋出体积与其
分子量有关,分子量愈大,其淋出体积愈小[7]。

图9-2 不同尺寸分子通过凝胶原理图
显然,凝胶色谱法的分离是严格地建立在分子尺寸基础之上的,通常不应该在固定相上发生对试样的吸着和吸附。同时,也不应该在固定相和试样之间发生化学反应(当然,也有一些凝胶色谱填料,例如,表面磺化交联聚苯乙烯颗粒,主要是基于分子尺寸大小而进行分离的。但其表面磺化层又与被测离子之间有轻微的离子交换作用)。

图9-3 凝胶渗透色谱分离不同分子尺寸试样示意图
凝胶渗透色谱法的特点是样品的保留体积不会超过色谱柱中溶剂的总量,因而保留值的范围是可以推测的,这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成色谱峰的重叠,提高了仪器的使用效率。其缺点则是柱容量较小。
通常洗脱剂分子是非常小的,它们的谱峰一般是在色谱图中最后出现(此时为)。显然,各被测物质均在之前被洗脱,即它们的均小于,这与液-液、液-固和离子交换色谱的情况正好相反。
色谱柱参数及其测定方法[6]
(1) 柱参数。将凝胶色谱柱填充剂的凝胶颗粒用洗脱剂溶胀,然后与洗脱剂一起填入柱中,此时,凝胶床层的总体积为
(9-1)
式()中,为柱中凝胶颗粒外部溶剂体积;为柱中凝胶颗粒内部吸入溶剂的体积;为凝胶颗粒骨架的体积。
、、和均称柱参数。在实验中,其数值均可以测定。
被测物质的洗脱体积
(9-2)
式()中,K为固定相和流动相之间的被测溶质的分配系数
(9-3)
式()中,为凝胶颗粒内部溶质能进入部分的体积。
由上可见,凝胶色谱分离的过程中,没有受到任何其它吸附现象或化学反应的影响,它完全基于分子筛效应。
若K=0,待测分子不能进入凝胶颗粒内部;
若0<K<1,待测分子可以部分地进入凝胶颗粒内部;
若K=1,待测分子完全浸透凝胶颗粒内部;
若K>1,表面存在吸附作用等其它影响存在。
若将用凝胶相的总体积代替,且
(9-4)
则有
(9-5)
(9-6)
式()中,、和都容易测定,所以在实际工作中,人们喜欢用。与之间的关系为
(9-7)
(2) 柱参数的测定。为色谱柱的内体积。为完全不能浸入凝胶颗粒内部的溶质分子的洗脱体积。
例如,可以通过聚苯乙烯等高分子化合物来测定和。例如,测定用氘标记丙酮和己烷(GPC)的,由公式